廣東地區(qū)高毒力肺炎克雷伯菌的微生物學(xué)特征

馬明蔥，李曉雨，萬喬，陳志旭，卓超

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 廣東 廣州 510000)

肺炎克雷伯菌，屬于革蘭陰性桿菌，可引起肺部感染、泌尿道感染和血液感染等[1]。近年來社區(qū)來源的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvkp)受到廣泛關(guān)注，是微生物感染的研究熱點。高毒力肺炎克雷伯菌是臺灣的科學(xué)家1986年發(fā)現(xiàn)的[2]，隨后在臺灣，韓國及其他亞洲國家均有報道[2,3,4]，而且在亞洲以外國家的報道也有所增加[5,6,7]。在其它地區(qū)報道的hvkp感染患者也主要是亞裔居民。hvkp不僅是導(dǎo)致肝膿腫的重要病原菌，還可引起腦膜炎、壞死性筋膜炎和眼內(nèi)炎等轉(zhuǎn)移性感染[8,9]，其進(jìn)展快、預(yù)后差，給患者的生命帶來極大威脅。hvkp菌株在瓊脂平板上的菌落表現(xiàn)為高黏液性(hypermucoviscous)，即拉絲實驗陽性，則判斷為高黏液表型菌株[5]，故既往將高毒力肺炎克雷伯菌又稱為高黏液表型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscous klebsiella pneumoniae，hmkp)。但對于高黏液表型肺炎克雷伯菌是否等同于高毒力肺炎克雷伯菌，近年報道也存在爭議，有研究通過小鼠實驗表明，僅少數(shù)(1/5)的高黏液表型菌株表現(xiàn)為高毒力[10]。

鐵載體氣桿菌素(iucA)占hvkp總的鐵載體產(chǎn)量的90.0%以上，和敲除氣桿菌素的菌株相比，含有氣桿菌素的菌株可使小鼠模型的毒力增加100倍[11]。有關(guān)hvkp菌株的定義尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。Thomas A. Russo等表明拉絲實驗定義hvkp的準(zhǔn)確性能達(dá)到90.0%，iucA定義hvkp的準(zhǔn)確性可達(dá)96.0%[12]。因此，在本文中我們將拉絲實驗和iucA基因陽性的肺炎克雷伯菌定義hvkp。與hvkp相對應(yīng)的是典型肺炎克雷伯菌(classic klebisella pneumonia，ckp)，ckp主要見于醫(yī)院感染，常因?qū)︻^孢菌素、碳青霉烯類的耐藥使其成為多重耐藥菌。普遍認(rèn)為ckp的毒力較低，但2016 年中國浙江的一家醫(yī)院發(fā)現(xiàn)了攜帶blaKPC-2克隆株ST11，可獲得高毒力質(zhì)粒，成為高耐藥和高毒力菌株，并造成患者致命的結(jié)局[13-14]。因此，基于這種細(xì)菌的進(jìn)化現(xiàn)象，以耐藥性來區(qū)分hvkp和ckp只是相對而言的，須根據(jù)每個菌株的多種生物學(xué)特征予以判斷。本研究的主要目的是比較性研究中國廣東地區(qū)的hvkp和ckp的臨床特征、細(xì)菌耐藥性、分子流行病學(xué)特點及相關(guān)毒力情況。

1 材料與方法

1.1 收集菌株及患者臨床資料

對2016年11月到2018年4月從廣東省4家醫(yī)院收集的194株培養(yǎng)陽性的肺炎克雷伯菌進(jìn)行回顧性研究。排除同一患者的重復(fù)分離株。所有細(xì)菌均經(jīng)Vitek 2 compact全自動化微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，儲存于-80℃。并經(jīng)16S rRNA基因測序再次鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 拉絲實驗

用接種環(huán)蘸取新鮮的肺炎克雷伯菌菌落，將接種環(huán)向上提起，若菌落形成的黏絲長度大于5 mm，則判定為拉絲實驗陽性，反之則陰性。拉絲試驗陽性的菌株為高黏液表型菌株[5]。

1.3 藥物敏感性試驗

采用肉湯稀釋法測定肺炎克雷伯菌對6種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，結(jié)果判斷參照2017年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的折點[15]。6種抗菌藥物為亞胺培南，頭孢呋辛，頭孢曲松，頭孢吡肟，環(huán)丙沙星和亞胺培南，均購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.4 菌株MLST分型

采用煮沸法提取菌株DNA的模板。PCR體系：PCR上下游引物各1.0 μL，Premix12.5 μL，超純水9.5 μL，DNA模板1.0ul，總共25.0 μL。PCR反應(yīng)條件詳見https://pubmlst.org網(wǎng)站。PCR陽性產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，并登錄(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_mlst_seqdef&page=sequenceQuery)網(wǎng)站獲得7個管家基因數(shù)目，和數(shù)據(jù)庫中的7個管家基因比對后獲得ST型。

1.5 血清型與毒力基因

毒力基因及血清型的PCR模板提取及反應(yīng)體系同前，PCR特異性引物參照文獻(xiàn)合成[12,16,17]。所得陽性產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，并上傳BLAST數(shù)據(jù)庫比對分析。

1.6 蠟螟實驗

參照文獻(xiàn)中蠟螟實驗標(biāo)準(zhǔn)方法[18]，并做簡要修改。

1.6.1方法 收集孵育于LB瓊脂平板上18-20 h分純的臨床肺炎克雷伯菌，將單菌落加PBS(PH=6.5)調(diào)麥?zhǔn)媳葷岫葹?.5，按照預(yù)先涂板計算的0.5麥?zhǔn)系木淞?cfu/ml)。依照10的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，得到104-107cfu/ml的細(xì)菌懸液。實驗組注射肺炎克雷伯菌菌液，對照組僅注射PBS。注射蠟螟的菌液需再次涂板計數(shù)驗證細(xì)菌量。

1.6.2蠟螟體內(nèi)注射 選取300-400 mg健康狀態(tài)良好(體白、運動活躍、翻身能力強(qiáng)等)的成熟幼蟲(人工飼料喂養(yǎng)(奶粉，蜂蜜，蜜蠟，小麥粉，玉米面)，相對濕度為60%-70%，并常規(guī)進(jìn)行消毒)，用注射器吸取20.0 ul細(xì)菌懸液，在蠟螟偽足的第一腹節(jié)進(jìn)針，將細(xì)菌懸液注入蠟螟體內(nèi)。所有的194株菌均進(jìn)行蠟螟實驗，每株細(xì)菌分4個不同濃度(104-107cfu/ml)，每個濃度的細(xì)菌菌液需注射30只蠟螟(即每組10只，重復(fù)3次)，則一株細(xì)菌需120只蠟螟。將感染的蠟螟放置培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿只放10只感染的蠟螟，37 ℃避光培養(yǎng)。

1.6.3記錄結(jié)果 間隔12 h(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)記錄蠟螟死亡數(shù)量，并用回歸分析方法中的probit概率法計算LD50(log10cfu/ml)，各組進(jìn)行比較時采用t檢驗或單因素分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，對計量資料采用t檢驗，多組計量資料的比較采用單因素分析，計數(shù)資料比較用卡方檢驗，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株的來源及hvkp菌株的陽性率

2016年11月到2018年4月，從廣東省4家醫(yī)院共收集了194株培養(yǎng)陽性的肺炎克雷伯菌，血標(biāo)本來源的肺炎克雷伯菌為70.1%(136/194)(圖1)。本研究中hvkp的比例為33.0%(64/194)。

圖1 194株肺炎克雷伯菌的標(biāo)本來源

2.2 藥物敏感性實驗

和ckp菌株相比，hvkp對本研究中的大多數(shù)抗菌藥物更敏感(P<0.05)。hvkp菌株對亞胺培南、阿米卡星、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢吡肟和環(huán)丙沙星的耐藥率顯著低于ckp菌株。(見表2)

表2 hvkp/ckp，血清型K1/K2的毒力基因百分比

表1 hvkp和ckp對不同抗菌藥物的耐藥情況比較

2.3 菌株MLST分型

對所有菌株(194株)進(jìn)行MLST分析，共有75個ST型，未分型9株(均在ckp組)。hvkp中主要的ST型為ST23(17/64,26.6%)、ST65(12/64,18.8%)、ST86(8/64,12.5%)，這3種ST型占總的hvkp的比例為57.8%(37/64)。ckp中主要的ST型為ST11(18/130,13.9%)、ST15(6/130，4.6%)，ST37(5/130,3.8%)，這3種ST型占總的ckp的比例為22.3%(29/130)。

2.4 血清型與毒力基因

2.4.1血清型 hvkp中92.2%(59/64)的菌株可進(jìn)行血清分型，ckp中僅17.7%(23/130)的菌株可進(jìn)行血清分型。64株hvkp的血清型分型中，K2型最多，占40.6%，其他血清型依次是K1型28.1%，K57型占15.6%，K20型占4.7%，K5型占3.2%，未發(fā)現(xiàn)血清型K54(見圖2)。130株ckp的血清型分型中，K1型為6.2%，依次是K2型5.4%，K54型占3.1%，K20型占1.5%，未發(fā)現(xiàn)血清型K5。血清型K1、K2、K57在hvkp中的檢出率顯著高于ckp(P<0.05)。

圖2 hvkp和ckp中不同血清型的百分比

2.4.2毒力基因 hvkp菌株中毒力基因rmpA、rmpA2、iucA、iroB、peg-344、Alls、entB、ycfM、Irp-2、ybts、fimH、kfuB、wabG、uge、magA等的陽性檢出率高于ckp菌株的檢出率，其余毒力基因的陽性率在兩組間無明顯區(qū)別(詳見表3)。血清型K1菌株中毒力基因kfuB、magA的陽性檢出率高于血清型K2，而K1的毒力基因kpn的陽性檢出率低于K2。其余毒力基因的檢出率在血清型K1和K2間無統(tǒng)計學(xué)差異(詳見表3)。

2.5 蠟螟實驗

蠟螟實驗結(jié)果表明，總的來說hvkp的LD50低于ckp(5.4±0.7(log10cfu/ml)vs5.6±0.7(log10cfu/ml)，P=0.035)，高黏液表型肺炎克雷伯菌的平均LD50低于非高黏液表型肺炎克雷伯菌(5.4±0.7(log10cfu/ml)vs5.6±0.7(log10cfu/ml)，P=0.026)。

比較hvkp和ckp間差異顯著的毒力基因(P=0.000)，以及血清型K1和K2間有區(qū)別的的毒力基因菌株，hvkp中毒力基因kpn陽性的菌株的LD50大于相應(yīng)的ckp菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.016)。其余表型的肺炎克雷伯菌感染蠟螟的LD50詳見表3。

表3 hvkp和ckp中肺炎克雷伯菌感染蠟螟的LD50(log10cfu/ml)的比較

3 討論

對2016年11月到2018年4月從廣東省4家醫(yī)院收集的不同感染部位的194株肺炎克雷伯菌進(jìn)行回顧性研究。本文中hvkp的比例為33.0%，低于我國北京對于老年人的一項6年的研究中的hvkp的比例(45.7%)[19]，但高于國外西班牙(6.0%)，加拿大(8.2%)等地區(qū)[5]。

除少數(shù)地區(qū)發(fā)現(xiàn)高毒力的肺炎克雷伯菌耐藥外[13]，大多數(shù)研究表明肺炎克雷伯菌高毒力株對常用抗菌藥物高度敏感[20]，本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報道基本一致。本組資料顯示64株hvKp菌株中發(fā)現(xiàn)5株耐藥菌株，其中一株ST65-K2表型的hvkp為多重耐藥菌株(MDR)，對亞胺培南敏感。該菌株分離自胸腔感染患者的胸腔引流液，其毒力較強(qiáng)，感染蠟螟的LD50為4.5，與高毒力參考菌株K1 血清型NTUH-K2044的LD50(4.1±0.3)相近[18]。該菌株的毒力和耐藥機(jī)制相互關(guān)系有待下一步研究。

先前研究表明，血清型K1在hvkp中是最常見的[14,20]，但在本研究分離的64株hvkp中，血清型K2最多，高達(dá)40.6%；K1次之(28.1%)。文獻(xiàn)報道ST23型與血清型K1和肝膿腫密切相關(guān)[5]，我們的研究結(jié)果與此相一致，但本研究中僅8例肝膿腫，可能與血清型K1少有關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，ST700和ST2059也與血清型K1相關(guān)，此兩類菌株均來源于血液標(biāo)本，但因臨床資料欠全，是否因肝膿腫播散性感染未能考證。來自新加坡，香港，臺灣的研究表明，血清型K2的ST型較多樣(8種ST型)[21]。本文中血清型K2的ST型也較多樣，以ST65最常見。先前的研究表明ST268僅與血清型K20相關(guān)[22]，本文中的ST268和ST893均為血清型K20。與既往研究一致，血清型K1、K2、K57與hvkp相關(guān)[22-23]。

既往研究顯示，rmpA/rmpA2，調(diào)節(jié)胞外脂多糖的合成，與高黏液表型密切相關(guān)，也認(rèn)為是hvkp 重要生物標(biāo)記物[24,25]，但在本研究中僅66.7%的hvkp為rmpA陽性，提示可能存在其他機(jī)制調(diào)節(jié)高黏液表型的表達(dá)[25]。此外，Guo等收集多種感染部位的肺炎克雷伯菌，結(jié)果表明與non-hvkp相比，hvkp中rmpA多，但rmpA在血清型K1和K2間無區(qū)別，與本文中hvkp的研究結(jié)果一致[22]。鐵載體腸桿菌素(entB)、氣桿菌素(iucA)、沙門菌素(iroB)、耶爾森菌素(ybts,irp-2)、kfu等均介導(dǎo)三價鐵的攝取，均是肺炎克雷伯菌感染的重要的毒力因子[26,27,28]。本文中iucA、iroB、ybts、irp-2、kfu等在hvkp中的陽性率高于ckp，和既往的研究一致。既往研究表明血液和肝膿腫中的肺炎克雷伯菌的血清型K1均有kfuB基因，但血清型K2均無[29]。Lin等收集香港、新加坡和臺灣的肝膿腫和非感染性攜帶者的血清型K2，結(jié)果表明血清型K2中kfuB基因的比例為11.5%[30]。本研究表明，K1中kfuB基因的比例為66.6%，K2中kfuB基因的比例為26.1%，表明kfu與血清型K1無特異性的關(guān)系。本研究中大多數(shù)的菌株攜帶fimH基因，但在hvkp菌株中的陽性率高于ckp，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與既往研究一致[22]。另外一個與菌毛相關(guān)的基因kpn，其陽性率在hvkp和ckp間無明顯差異，但在血清型K2中的陽性率高于K1。

和既往小鼠模型研究結(jié)果一致[31]，本研究蠟螟實驗顯示，高黏液表型的肺炎克雷伯菌的毒力強(qiáng)于非高黏液表型的肺炎克雷伯菌，hvkp的毒力強(qiáng)于ckp。毒力基因的比較發(fā)現(xiàn)，除毒力基因kpn外，未發(fā)現(xiàn)其余表型在hvkp和ckp間的差異，表明不能僅單一依靠一種表型定義hvkp。毒力基因kpn陽性的菌株中hvkp的毒力大于ckp，表明該基因可能成為鑒定高毒力的生物標(biāo)志。另血清型K2中有3株ST25，2株毒力基因kpn陽性，蠟螟實驗表明其毒力較強(qiáng)，LD50與K1參考株(NTUH-K2044)的LD50(4.1±0.3)一致[18]；它們是收集自不同時間同一科室的細(xì)菌，1株來自血液，2株來自引流物，治療期間給與了美羅培南，阿米卡星，環(huán)丙沙星的聯(lián)合治療。該3例患者的臨床結(jié)局均為死亡。雖然高毒力的ST25-K2肺炎克雷伯菌目前未形成流行克隆，但基于其高危害性，在臨床監(jiān)測中應(yīng)警惕[32,33]。