PFKFB4對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響及其作用機(jī)制

王 鳴 孫梯業(yè)

胃癌是我國(guó)較常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一[1]，由于缺乏有效的治療手段，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)胃癌在惡性腫瘤中排名第五，但在癌癥相關(guān)死亡中排名第三[2]。由于早期胃癌診斷率較低，許多患者就診時(shí)已經(jīng)是中晚期。目前手術(shù)結(jié)合化療的傳統(tǒng)治療手段預(yù)后較差，因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)適用于胃癌患者的分子診斷和治療新靶標(biāo)。

6-磷酸果糖-2-激酶/2，6-二磷果糖酸酶4(PFKFB4)催化合成2，6-二磷酸果糖，2，6-二磷酸果糖作為一種重要的磷酸糖代謝產(chǎn)物參與糖酵解途徑。目前對(duì)于PFKFB4的研究更多側(cè)重于其在腫瘤中通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝來(lái)控制腫瘤的生長(zhǎng)[3]。近期在乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)PFKFB4能夠通過(guò)對(duì)SCR-3(Steroid receptor coactivator-3，又被稱為NCOA3)的磷酸化提高SRC-3的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而啟動(dòng)下游相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的惡化和轉(zhuǎn)移[4]。有研究表明，在胃癌細(xì)胞中PFKFB4基因及蛋白的表達(dá)水平均明顯升高。但目前對(duì)于其在胃癌中的作用研究仍然局限于低氧環(huán)境下的糖代謝過(guò)程[5]。本研究檢測(cè)了胃癌細(xì)胞中能夠與PFKFB4有相互作用的SRC家族(p160/Steroid receptor coactivator family)蛋白，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)尋找SRC蛋白的下游調(diào)控基因LKB1(Liver kinase B1，也被稱為STK11)，并進(jìn)一步研究這一調(diào)控路徑在胃癌轉(zhuǎn)移及惡化中的功能，以期為胃癌的治療提供新的分子靶標(biāo)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

將凍存的人胃癌細(xì)胞系MNK45從液氮中取出，置于37℃水浴中迅速溶解，解凍后細(xì)胞離心去除凍存液。離心的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有10% FBS、青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

siSRC-2+S698WT 載體購(gòu)自O(shè)rigene，siSRC-2+S698A定點(diǎn)突變序列為：siSRC-2+S698A F：5′-GGACAGCaagTCCCCTGTGGA-3′，R：5′-CAGGGGActtGCTGTCCTGCA-3′，使用Hieff MutTMSite-Directed Mutagenesis Kit 定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將Ser698突變?yōu)锳sp698。

本研究中所用引物序列分別為：

PFKFB4-F：5′-CGATACCTGAACTGGATTGGT-3′，PFKFB4-R：5′-GGCACACTGCTTCCTGATTT-3′；SRC-2-R：5′-GGACCTGGTAAGAAGGTGTATTCAG-3′，SRC-2-F：5′-TGCCTCTTAGCATAGGACACAGA-3′；LKB1-F，5′-GCCGGGACTGACGTGTAGA-3′，LKB1-R：5′-CCCAAAAGGAAGGGAAAAACC-3′；ACTB-F：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，ACTB-R：5′-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′。 文中所用抗體除anti-pSRC-2(Ser469)、anti-pSRC-2(Ser487)和anti-pSRC-2(Ser493)，所用肽段序列參照文獻(xiàn)[7]自行制備外，其余抗體購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白免疫共沉淀 (0.5～1)×107個(gè)MNK45細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，0.25%胰酶消化后PBS再洗3次。加入1 mL含蛋白酶抑制劑和RIPA的裂解液，4℃放置45 min，12 000 rpm 4℃離心10 min，收集上清液，加入抗體，4℃孵育過(guò)夜；再與預(yù)處理后的Protein A瓊脂糖珠在4℃條件下孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，用IP裂解液清洗5～7次，最后用Western blot法分析結(jié)果。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞系MNK45待細(xì)胞達(dá)到80%～90%進(jìn)行傳代，取3-5代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用Lipofectamine 2 000進(jìn)行轉(zhuǎn)染MNK45細(xì)胞，將序列(5′-CACTTGTATGGTCCTGT-3′)轉(zhuǎn)染MNK45細(xì)胞獲得siPFKFB4組細(xì)胞；將序列(5′-GGGCTGTTAACATTAGCAA-3′)轉(zhuǎn)染MNK45細(xì)胞獲得siSRC-2細(xì)胞組[3]；將序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)轉(zhuǎn)染MNK45細(xì)胞獲得NC siRNA細(xì)胞組[6]；將購(gòu)自O(shè)rigene的LKB1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MNK45細(xì)胞獲得OE LKB1細(xì)胞組，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h和72 h取細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染siSRC-2序列24 h后，將載體siSRC-2+S698WT和siSRC-2+S698A分別轉(zhuǎn)染至siSRC-2組細(xì)胞，獲得siSRC-2野生型互補(bǔ)siSRC-2+S698WT組細(xì)胞及siSRC-2Ser6987突變互補(bǔ)siSRC-2+S698A組細(xì)胞(Ser6987突變?yōu)锳sp698)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組：NC siRNA組(干擾對(duì)照組)、siPFKFB4組(PFKFB4干擾組)、siSRC-2組(SRC-2干擾組)、OE LKB1組(過(guò)表達(dá)LKB1組)、siSRC-2+S698WT組(野生型SRC-2互補(bǔ)組)及siSRC-2+S698A組(Ser698位點(diǎn)突變的SRC-2互補(bǔ)組)。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 用TRIzol提取siSRC-2組和NC siRNA組細(xì)胞的總RNA，利用Qubit 3.0進(jìn)行RNA定量，Agilent 2100生物分析儀評(píng)估RNA提取質(zhì)量，樣品檢驗(yàn)合格后測(cè)序，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。獲取原始序列后對(duì)比人類基因組序列進(jìn)行MAP和比對(duì)，通過(guò)RPKM值估算基因表達(dá)量，獲得兩組細(xì)胞的差異表達(dá)基因。

1.2.5 qRT-PCR 檢測(cè)PFKFB4、SRC-2和LKB1在MNK45細(xì)胞中的表達(dá)，采用TRIzol試劑提取總RNA，利用SuperScriptase II試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR的步驟同文獻(xiàn)所述[4]。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，選擇β-actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，用2-ΔΔCt法對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析，在擴(kuò)增的指數(shù)期起始模板進(jìn)行定量。

1.2.6 蛋白免疫印跡 采用Western blot的方法檢測(cè)MNK45細(xì)胞中PFKFB4、LKB1、SRC-2的蛋白量及SRC-2蛋白磷酸化程度。利用含蛋白酶抑制劑和RIPA的裂解液裂解細(xì)胞，在4℃下13 000 rpm離心12 min并收集上清液。利用BCA法進(jìn)行蛋白定量，蛋白變性后上樣，電泳分離使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。室溫5%～10%脫脂奶粉封閉后，在4℃分別與一抗孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1.5 h，在膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光底物曝光，用紅外成像檢測(cè)蛋白印跡帶，以β-actin為內(nèi)參，用“Quantity one”對(duì)條帶灰度值定量。抗體使用濃度分別為：anti-β-actin(1∶5 000)，anti-PFKFB4(1∶1 000)，anti-SRC-2(1∶2 000)，anti-LKB1(1∶1 000)，anti-pSRC-2(Ser736)(1∶800)，anti-pSRC-2(Ser698)(1∶1 000)，anti-pSRC-2(Ser469)(1∶500)，anti-pSRC-2(Ser487)(1∶750)，anti-pSRC-2(Ser493)(1∶500)。

1.2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell培養(yǎng)池放入24孔板中，上室分別加入100 μL稀釋好的NC siRNA組、siPFKFB4組、siSRC-2組及OE LKB1組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液，上述處理后的4組細(xì)胞分別接種3～5個(gè)小室，下室加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)池，倒去培養(yǎng)基，擦去下室內(nèi)表面未穿膜的細(xì)胞，用甲醇固定15 min，加入染色液DAPI室溫染色10 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡拍照。

1.2.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取上述處理后的4組細(xì)胞在60 μL的Matrigel加入300 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，4℃混勻，加至Transwell小室，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4～5 h至培養(yǎng)基凝固，剩余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上獨(dú)立樣本比較采用方差分析(ANOVA)，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與PFKFB4有相互作用的SRC家族蛋白的檢測(cè)

SRC家族包含三個(gè)成員，分別為SRC-1、SRC-2和SRC-3，本研究通過(guò)免疫共沉淀方法能夠檢測(cè)在胃癌細(xì)胞MNK45中與PFKFB4相互作用的SRC蛋白。結(jié)果顯示只有SRC-2與PFKFB4有明顯的相互作用(圖1)。

圖1 CO-IP檢測(cè)MNK45細(xì)胞中與PFKFB4有相互作用的SRC家族蛋白Figure 1 The SRCs protein interact with PFKFB4 in MNK45 cells by CO-IP

2.2 PFKFB4對(duì)SCR-2表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)NC siRNA組和siPFKFB4組細(xì)胞中PFKFB4和SRC-2蛋白表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明SRC-2蛋白(圖2A)和mRNA(圖2B)的表達(dá)量在兩組細(xì)胞中沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明下調(diào)PFKFB4并不影響SRC-2的表達(dá)。

2.3 PFKFB4磷酸化SRC-2的檢測(cè)

有文獻(xiàn)表明與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的SRC-2磷酸化位點(diǎn)有Ser469、Ser487、Ser493、Ser698及Ser736[7-9]，因此本研究分別用帶有上述磷酸化位點(diǎn)的抗體檢測(cè)PFKFB4對(duì)SRC-2的磷酸化作用，同時(shí)檢測(cè)其磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示盡管SRC-2的表達(dá)不受PFKFB4的影響，但PFKFB4能夠磷酸化SRC-2的Ser698位點(diǎn)，Ser698的磷酸化程度隨PFKFB4表達(dá)量降低而降低(圖3)。

圖2 PFKFB4對(duì)SRC-2表達(dá)的影響Figure 2 Effect of PFKFB4 on the expression of SRC-2 at levels of protein and mRNA in MNK45 cellsNote：***P<0.001，when compare with the NC siRNA group.

圖3 PFKFB4對(duì)SRC-2的磷酸化作用及位點(diǎn)檢測(cè)Figure 3 PFKFB4 was detected phosphorylated sites of SRC-2 in MNK45 cells

2.4 SRC-2磷酸化對(duì)LKB1基因表達(dá)的影響

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析NC siRNA組和siSRC-2組差異表達(dá)mRNA的情況，圖4A展示了10個(gè)表達(dá)差異變化最大的基因，其中LKB1的表達(dá)水平在siSCR-2組變化最為明顯。用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)LKB1的mRNA表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致且差異最為明顯(圖4B)。為檢測(cè)是SRC-2表達(dá)量不同還是磷酸化差異對(duì)LKB1的表達(dá)產(chǎn)生了影響，本研究在siSRC-2組細(xì)胞中轉(zhuǎn)入能表達(dá)野生型Ser698的siSRC-2+S698WT回補(bǔ)質(zhì)粒和Ser698位點(diǎn)突變的siSRC-2+S698A質(zhì)粒，并檢測(cè)這兩組細(xì)胞中LKB1蛋白和mRNA的表達(dá)，與NC siRNA組及siSRC-2組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)只有siSRC-2+S698WT組細(xì)胞的LKB1才能恢復(fù)到NC siRNA的表達(dá)水平，而Ser698位點(diǎn)突變的siSRC-2+S698A組細(xì)胞中LKB1的表達(dá)顯著高于NC siRNA，與siSRC-2組細(xì)胞持平(圖4C、D)。

2.5 MNK45細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)

利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞MNK45的遷移和侵襲能力。與NC siRNA組相比，siPFKFB4組、siSRC-2組和OE LKB1組細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到了顯著的抑制(利用SLD方法進(jìn)行組間分析，α=0.05)(圖5)。

圖4 SRC-2對(duì)LKB1表達(dá)的影響Figure 4 Effects of SRC-2 on the expression of LKB1 gene at levels of mRNA and proteinNote：*P<0.05，**P<0.01，when compared with the NC group.# P<0.05，when compared with siSRC-2 group.

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MNK45細(xì)胞遷移和侵襲能力Figure 5 Effects of PFKFB4 on migration and invasion of MNK45 cellsNote：A.The cells of migration or invasion were observed under a fluorescence microscope；B.Statistical results of migration were analyzed in MNK45 cells.

3 討論

PFKFB4基因編碼6-磷酸果糖-2-激酶/2，6-二磷果糖酸酶4(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase 4)，能夠催化合成2，6-二磷酸果糖，2，6-二磷酸果糖作為一種重要的磷酸糖代謝產(chǎn)物參與糖酵解途徑。PFKFB4基因最初發(fā)現(xiàn)于人的睪丸中，在特定時(shí)間內(nèi)參與精子的成熟過(guò)程[10-11]，隨后發(fā)現(xiàn)它在多個(gè)器官的正常組織中亦有表達(dá)[12-13]。2018年，Dasgupta等[4]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，PFKFB4能夠磷酸化SRC-3的S857位點(diǎn)，從而提高SRC-3的轉(zhuǎn)錄活性。由此我們認(rèn)識(shí)到PFKFB4除作為關(guān)鍵成員參與腫瘤細(xì)胞的厭氧糖代謝外，還是一個(gè)重要的磷酸激酶，能夠提高轉(zhuǎn)錄因子的活性，在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和惡化過(guò)程中發(fā)揮作用。有研究表明，PFKFB4在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)[3]。在胃癌細(xì)胞中闡明PFKFB4是否會(huì)發(fā)揮與其在乳腺癌細(xì)胞中類似的功能，激活SRC家族蛋白，從而促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移及惡化具有重要的意義。

SRC家族是第一個(gè)被鑒定的核受體輔激活子[14-17]，有三個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，分別為SRC-1(NCOA-1，RIP160[18])，SRC-2(NCOA-2，TIF-2，GRIP-1[19-20])和SRC-3(NCOA-3，AIB-1，TRAM-1，pCIP[21-23])。SRC能夠通過(guò)二級(jí)協(xié)同蛋白增強(qiáng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[18]，SRC具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)域，它們的功能通過(guò)被包括磷酸化在內(nèi)轉(zhuǎn)錄后翻譯所調(diào)節(jié)和擴(kuò)展[24]。SRC-1參與胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲的信號(hào)通路，且SRC-1低表達(dá)患者預(yù)后及五年生存期明顯低于高表達(dá)患者[25]，而SRC-3在多種癌癥細(xì)胞中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[26]。SRC-2作為核受體的轉(zhuǎn)錄輔激活子，在不同的生理過(guò)程中發(fā)揮著多種作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、能量代謝、晝夜節(jié)律、進(jìn)食行為和心臟功能[27-31]。有研究表明SRC-2是前列腺癌的關(guān)鍵致癌基因，在轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤中，SRC-2基因的擴(kuò)增、過(guò)表達(dá)和突變水平能夠升高38%[32]，且SRC-2的表達(dá)水平與前列腺腫瘤細(xì)胞增殖及疾病復(fù)發(fā)呈正相關(guān)[33]。在乳腺癌細(xì)胞中，SRC-2可以通過(guò)正向調(diào)控MAPK/ERK途徑促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。而SRC-2在胃癌中的作用以及其與PFKFB4的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道，在本研究中我們通過(guò)免疫共沉淀的方法確定在胃癌細(xì)胞中PFKFB4與SRC-2有相互作用，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PFKFB4能夠磷酸化SRC-2的Ser698位點(diǎn)。

為明確SRC-2磷酸化在胃癌細(xì)胞中的作用，本研究首先對(duì)siSRC-2組和NC siRNA組細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)分析差異表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)SRC-2表達(dá)后，LKB1(Liver kinase B1，也被稱為STK11)的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。LKB1是腫瘤抑制因子，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)展和進(jìn)展[34]。為證實(shí)這一結(jié)果，利用Western blot和qRT-PCR檢測(cè)了LKB1在siSRC-2組中蛋白和mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)SRC-2表達(dá)降低后，LKB1的表達(dá)顯著增加。為證實(shí)LKB1的表達(dá)與SRC-2 Ser698磷酸化的關(guān)系，將攜帶野生型SRC-2及Ser698位點(diǎn)突變的SRC-2 cDNA全長(zhǎng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)siSRC-2組，得到siSRC-2+S698WT細(xì)胞組和siSRC-2+S698A細(xì)胞組，并檢測(cè)LKB1在這些細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明只有siSRC-2+S698WT組的LKB1表達(dá)量恢復(fù)到NC siRNA組的水平。

綜上所述，在胃癌細(xì)胞MNK45中，PFKFB4能夠磷酸化轉(zhuǎn)錄輔因子SRC-2的Ser698位點(diǎn)，從而提高SRC-2的轉(zhuǎn)錄活性，抑制抑癌基因LKB1的表達(dá)，從而保證胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。我們的研究表明，PFKFB4-SRC-2可能可以作為潛在的靶標(biāo)，在胃癌的靶向治療中發(fā)揮作用。