LncRNA NBAT1通過調(diào)控miR-3664-5p/Caspase 9分子軸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

趙云霞 牛 波

近年來乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病率排在女性惡性腫瘤的首位[1-2]。其最主要的治療手段依然是外科手術(shù)和化療[3]。但是，腫瘤細(xì)胞耐藥的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了乳腺癌治療效果[4]。因此，探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的生物治療靶點(diǎn)依然是目前亟待解決的重大課題[5]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是指轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸并且不翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA分子。lncRNA與人類健康和疾病密切相關(guān)[6-8]。大量研究表明lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能，lncRNA與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。目前已鑒定出HOTAIR、FBXL19-AS1、H19等乳腺癌相關(guān)lncRNA[11-12]。成神經(jīng)細(xì)胞瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(Neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1)是一種腫瘤抑制基因，其表達(dá)缺失與成神經(jīng)細(xì)胞瘤增殖能力密切相關(guān)[13]。近期發(fā)現(xiàn)，NBAT1也在骨肉瘤、腦膠質(zhì)瘤、肺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[14-16]。但是，關(guān)于lncRNA NBAT1在乳腺腫瘤中的作用機(jī)制尚不十分清楚，本研究將重點(diǎn)探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；mimics miR-3664-5p和ASO-miR-3664-5p及其對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；過表達(dá)質(zhì)粒載體(pcDNA3-NBAT1)和對(duì)照質(zhì)粒載體(pcDNA3-NC)購(gòu)自天津賽爾生物技術(shù)有限公司；MCF-10A專用DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RT及PCR引物均由金唯智公司合成，miR-3664-5p的RT引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACACTCATG-3′；U6的RT引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAA TATGGAAC-3′；NBAT1上游序列為5′-CTCCACCCATTTGTAAGC-3′，下游序列為5′-AATACCCATGAGTCCATAC-3′；GAPDH的上游序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；miR-3664-5p的上游序列為5′-TGCGGAACTCTGTCTTCACTCATG-3′，U6上游序列為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，miR-3664-5p和U6的下游均為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)染

細(xì)胞系MCF-10A置于含5%馬血清，10 μg/mL胰島素，20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子，100 ng/mL霍亂毒素，0.5 μg/mL氫化可的松的DMEM/F12專用培養(yǎng)基中，人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7均置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，表達(dá)lncRNA NBAT1最低的MCF-7細(xì)胞用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。當(dāng)MCF-7細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，pc-NC組和pc-NBAT1組分別轉(zhuǎn)染pcDNA3-NC載體和pcDNA3-NBAT1載體， pc-NC+mimics NC組、pc-NBAT1+mimics NC組及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p組分別轉(zhuǎn)染pcDNA3-NC+mimics NC、pcDNA3-NBAT1+mimics NC及pcDNA3-NBAT1+mimics miR-3664-5p，轉(zhuǎn)染均按照脂質(zhì)體Lipo8000TM說明書進(jìn)行。

1.3 RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，及MCF-7細(xì)胞pc-NC組和pc-NBAT1組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)NanoDrop分析儀檢測(cè)，OD260/OD280為1.8～2.0。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。NBAT1的定量檢測(cè)以GAPDH為內(nèi)參，miR-3664-5p的定量檢測(cè)以U6為內(nèi)參，均采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot法檢測(cè)Caspase 9蛋白表達(dá)

收集MCF-7細(xì)胞pc-NC組、pc-NBAT1組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，用RIPA裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取各組蛋白樣品30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用PVDF轉(zhuǎn)膜，加入Caspase 9以及GAPDH一抗(1∶1 000)孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后，在ECL發(fā)光液下顯影，用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)曝光并對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證

采用美國(guó)Promega公司的pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，分別化學(xué)合成lncRNA NBAT1、Caspase 9的3′UTR區(qū)與miR-3664-5p的結(jié)合位點(diǎn)序列片段，并插入 pmirGLO luciferase表達(dá)載體中，獲得野生型載體pmirGLO/NBAT1和pmirGLO/Caspase 9-UTR，同樣的方法合成突變序列，獲得突變型載體pmirGLO/NBAT1-m和pmirGLO/Caspase 9-mUTR，將pmirGLO/NBAT1和pmirGLO/Caspase 9-UTR野生型載體、pmirGLO/NBAT1-m和pmirGLO/Caspase 9-mUTR突變型載體、mimics miR-3664-5p模擬物或者反義核酸ASO-miR-3664-5p及陰性對(duì)照組分別與Lipo8000TM 脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書，并以海腎熒光值作為內(nèi)參。計(jì)算螢火蟲熒光值與海腎熒光值的比值，評(píng)估報(bào)告基因在細(xì)胞中的相對(duì)活力。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

MCF-7細(xì)胞接種至96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)。pc-NC組、pc-NBAT1組或pc-NC+mimics NC組、pc-NBAT1+mimics NC組及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p組轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h、118 h后，每孔中同時(shí)加入90 μL新鮮的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液和10 μL的CCK-8溶液，然后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。用免疫酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 處的吸光度OD值，以各組平均值反映細(xì)胞增殖能力。

1.7 平板克隆分析

pc-NC組、pc-NBAT1組或pc-NC+mimics NC組、pc-NBAT1+mimics NC組及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p組轉(zhuǎn)染24 h后，200個(gè)細(xì)胞/孔接種于12孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換液1次。15天后，棄去培養(yǎng)基，甲醇固定20 min后，每孔加入400 μL的1%結(jié)晶紫染色液，室溫染色10 min，水漂洗5 min，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNA NBAT1的表達(dá)量

通過在線軟件Starbase分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)lncRNA NBAT1在1 104例乳腺癌組織中的表達(dá)量顯著低于其在113例正常乳腺組織中的表達(dá)量(P<0.001)(圖1A)。lncRNA NBAT1在正常對(duì)照細(xì)胞株MCF-10A細(xì)胞中表達(dá)量最高，在MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞中其表達(dá)量比MCF-10A低(P<0.001)，在MCF-7細(xì)胞中其表達(dá)量最低(P<0.001)(圖1B)。

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNA NBAT1、miR-3664-5p、Caspase 9三者的關(guān)系及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證

運(yùn)用Targetscan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)miR-3664-5p和lncRNA NBAT1及Caspase 9的結(jié)合位點(diǎn)(圖2A、2B)。并使用pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果顯示，mimics miR-3664-5p能夠抑制熒光素酶表達(dá)(P<0.001)，ASO-miR-3664-5p能夠促進(jìn)熒光素酶表達(dá)(P<0.001)，但是當(dāng)miR-3664-5p結(jié)合位點(diǎn)突變后，抑制和促進(jìn)作用均消失(圖2C、2D)，進(jìn)一步證明lncRNA NBAT1可以吸附miR-3664-5p，同時(shí)Caspase 9是miR-3664-5p的靶基因。

2.3 過表達(dá)lncRNA NBAT1對(duì)MCF-7中miR-3664-5和Caspase 9表達(dá)的影響

lncRNA NBAT1過表達(dá)載體pcDNA3-NBAT1和對(duì)照載體pcDNA3-NC分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，qPCR方法檢測(cè)pc-NBAT1組lncRNA NBAT1的表達(dá)較pc-NC組增高(P<0.001)；qPCR檢測(cè)pc-NBAT1組miR-3664-5的表達(dá)較pc-NC組降低(P<0.001)；Western blot檢測(cè)pc-NBAT1組Caspase 9蛋白的表達(dá)較pc-NC組增高(P<0.001)(圖3)。

2.4 CCK-8和克隆形成檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

CCK-8和克隆形成檢測(cè)過表達(dá)lncRNA NBAT1后細(xì)胞的增殖能力降低；如果同時(shí)將lncRNA NBAT1過表達(dá)載體和mimics miR-3664-5p轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)miR-3664-5p過表達(dá)能夠緩解過表達(dá)lncRNA NBAT1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)(圖4)。

圖1 lncRNA NBAT1在組織和細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 The expression of lncRNA NBAT1 in breast tissues and breast cell linesNote：A.The expression of lncRNA NBAT1 in breast cancer and normal tissues；B.The expression of lncRNA NBAT1 in breast cancer cell lines and normal cell line.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared with the MCF-10A group(n=3).

圖2 lncRNA NBAT1、miR-3664-5p、Caspase 9三者的靶定關(guān)系的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證Figure 2 The predicted binding sites of miR-3664-5p in lncRNA NBAT1 and Caspase 9 by the dual-luciferase reporter systemNote：A.The predicted binding sites of miR-3664-5p in lncRNA NBAT1 and lncRNA NBAT1 mutant sequences；B.The predicted binding sites of miR-3664-5p in Caspase 9-UTR and Caspase 9-mUTR sequences；C.Dual-luciferase reporter analysis for the miR-3664-5p binding to lncRNA NBAT1；D.Dual-luciferase reporter analysis to confirm that the Caspase 9 was a target-gene of miR-3664-5p.***P<0.001，when compared with the mimics NC group(n=3).

圖3 MCF-7細(xì)胞過表達(dá)NBAT1后對(duì)miR-3664-5和caspase9表達(dá)的影響Figure 3 The effect of lncRNA NBAT1 on the expression of miR-3664-5 and Caspase 9Note：A.qPCR analysis for the relative expression of lncRNA NBAT1 in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids；B.qPCR analysis for the relative expression of miR-3664-5p in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids；C.Western blot analysis for the relative protein expression of Caspase 9 in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids.***P<0.001，when compared with the pc-NC group(n=3).

圖4 CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA NBAT1對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖能力影響Figure 4 The effects of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by CCK-8 and colony formating assaysNote：A.The effect of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by CCK8 assay；B.The effect of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by colony formating assay；C.CCK-8 assay for the rescue effect of miR-3664-5p on the proliferation of MCF-7 with lncRNA NBAT1 overexpression；D.Colony formation assay for the rescue effect of miR-3664-5p on the proliferation of MCF-7 with lncRNA NBAT1′s overexpression.***P<0.001，when compared with the pc-NC group(n=3).

3 討論

lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，lncRNA可以通過染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方式參與機(jī)體的表觀遺傳調(diào)控。lncRNA參與了細(xì)胞增殖分化、神經(jīng)發(fā)育、免疫穩(wěn)態(tài)、腫瘤發(fā)生等生命過程[6]。lncRNA在乳腺癌的研究有許多進(jìn)展，lncRNA FBXL19-AS1在乳腺癌中高表達(dá)，通過抑制has-miR-718，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。lncRNA-PANDAR在乳腺癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，可以抑制p16的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[17]。lncRNA NBAT1在乳腺癌中的作用并不清楚，研究其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，將有助于更加全面地了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

在本研究中，通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA NBAT1的表達(dá)分析比較，發(fā)現(xiàn)lncRNA NBAT1低表達(dá)于乳腺癌組織當(dāng)中。lncRNA NBAT1可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程具有一定的調(diào)控作用。為進(jìn)一步探討lncRNA NBAT1在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本研究應(yīng)用重組質(zhì)粒在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中特異性過表達(dá)lncRNA NBAT1，通過CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，過表達(dá)lncRNA NBAT1對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力有明顯抑制作用。lncRNA的作用機(jī)制較為復(fù)雜，其中一種重要機(jī)制即是作為分子海綿與microRNA結(jié)合進(jìn)而抑制其對(duì)下游相應(yīng)靶mRNA的沉默效應(yīng)。通過Targetscan在線生物信息學(xué)網(wǎng)站的檢索表明，miR-3664-5p可能是lncRNA NBAT1的結(jié)合分子之一。綜上可推測(cè)，lncRNA NBAT1的抗乳腺癌細(xì)胞增殖作用可能是通過吸附miR-3664-5p的來實(shí)現(xiàn)的。為證實(shí)這一假說，本研究通過過表達(dá)MCF-7細(xì)胞內(nèi)lncRNA NBAT1，采用RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)lncRNA NBAT1可明顯抑制MCF-7細(xì)胞內(nèi)miR-3664-5p的表達(dá)水平。Targetscan在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析表明Caspase 9基因是miR-3664-5p的下游抑制靶點(diǎn)。Caspase 9是內(nèi)源性凋亡通路中關(guān)鍵蛋白酶，處在凋亡相關(guān)基因Caspase頂端[18]。Caspase 9可以激活細(xì)胞凋亡途徑中的最關(guān)鍵酶Caspase 3，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此，它的活化對(duì)于整個(gè)內(nèi)源性凋亡通路的激活尤為重要。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)lncRNA NBAT1后MCF-7細(xì)胞內(nèi)Caspase 9的表達(dá)水平也有所提高，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。至此，本研究初步表明lncRNA NBAT1的作用機(jī)制是通過吸附miR-3664-5p發(fā)揮作用，進(jìn)而釋放對(duì)Caspase 9的抑制作用而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-3664-5p和Caspase 9的靶向關(guān)系。

綜上所述，lncRNA NBAT1在乳腺癌組織中表達(dá)降低，主要通過減少miR-3664-5p的吸附，進(jìn)而抑制Caspase 9的表達(dá)而促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖。lncRNA NBAT1作為與乳腺癌密切相關(guān)的新分子，有可能成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。