SOX11 抑制食管癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究

趙楠楠 秦 文 韓永煥 魯 靜 李亞敏 徐亞君

食管癌(Esophageal cancer，EC)是最常見的消化道惡性腫瘤。在癌癥死亡譜排名中，食管癌排名第四；最新數(shù)據(jù)分析顯示，其發(fā)病率為17/10萬[1-3]。食管癌的確切機(jī)制尚不清楚，與化學(xué)刺激、炎癥、創(chuàng)傷、遺傳和生活習(xí)慣密切相關(guān)。近年來，基因組學(xué)的深入研究為食管癌的發(fā)生機(jī)制和診療指明了新的方向和研究思路。

SOX(SRY-related HMG-box)基因家族成員首次通過同源HMG域的決定因子SRY鑒定[4]，其蛋白產(chǎn)物調(diào)控多種生物學(xué)行為進(jìn)程，如早期胚胎發(fā)育、心臟發(fā)育和造血[5]、腎和肺發(fā)育[6-7]、神經(jīng)發(fā)育[8]等。SOX11是 SOX家族C組成員，研究表明SOX11能促進(jìn)淋巴瘤套細(xì)胞瘤的腫瘤進(jìn)程[9-10]，同時調(diào)控黑色素瘤和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[11-12]。另有文獻(xiàn)顯示，SOX11在小細(xì)胞肺癌、白血病和Burkett ′s淋巴瘤腫瘤組織中差異性表達(dá)，發(fā)揮抑癌或促癌作用[13-15]，這些研究提示SOX11在腫瘤的差異性作用可能與組織特異性和腫瘤微環(huán)境相關(guān)。但SOX11在食管癌中的表達(dá)和功能尚不清楚。本研究通過考察SOX11在食管癌中的表達(dá)、功能和機(jī)制，以期揭示其對食管癌發(fā)生發(fā)展的意義。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞系和臨床組織樣本

食管癌細(xì)胞(EC109、KYSE150、 KYSE410 和 KYSE510)和食管上皮細(xì)胞 HEEC購自中科院細(xì)胞生物庫。細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃，5% CO2細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。收集2012年1月—2017年1月赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院診治的56例食管癌患者的臨床樣本，食管癌組織和癌旁組織(指距病灶2 cm的切緣陰性的非腫瘤組織[16])以及正常食管上皮組織15例(正常食管組織來源于體檢篩查患者)。本研究獲得赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，同時獲得了所有患者知情同意并簽字，組織標(biāo)本病理診斷由赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科高年制醫(yī)師診斷和提供。食管癌的診斷依據(jù)2018中國食管癌診治指南[16]。本研究食管癌患者年齡36～71歲，中位年齡52.3歲；其中男性29例，女性27例；本研究正常食管患者年齡44～62歲，中位年齡49.6歲；其中男性9例，女性6例。年齡和性別沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。所有腫瘤患者均為原發(fā)性食管癌，手術(shù)切除前均未接受化療、放療或其他治療，無其他合并腫瘤；排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不全者、合并嚴(yán)重糖尿病心臟病的疾病和轉(zhuǎn)移性腫瘤等。

1.2 細(xì)胞和組織RNA提取

細(xì)胞和臨床樣本中的RNA提取步驟同文獻(xiàn)報道[17]。提取后RNA在Landdrop儀器中測得濃度后-80℃保存；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)為cDNA，實(shí)驗(yàn)方法及步驟參考樣品實(shí)驗(yàn)說明書及參考文獻(xiàn)。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA放于-20℃冰箱中保存。

1.3 SOX11過表達(dá)載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長狀態(tài)下的食管癌細(xì)胞EC109，消化、離心并種于六孔板中，37℃細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度至80%～90%時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染載體Lipofectamine-2000，分別轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-Flag-SOX11 質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)和對照質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-Flag-Vector(對照組)，每孔4 μg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR

qRT-PCR檢測SOX11 mRNA 在食管癌細(xì)胞系和臨床組織標(biāo)本中的相對表達(dá)：實(shí)驗(yàn)步驟同試劑盒使用說明書和文獻(xiàn)所述[18]。實(shí)時檢測 PCR 擴(kuò)增，選擇 GAPDH 作為內(nèi)參基因，每組樣品重復(fù)三次，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量，擴(kuò)增指數(shù)越高，相對表達(dá)越高。采用2-ΔΔCt法計算 SOX11 的 mRNA 相對表達(dá)水平。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。本研究中引物序列如下：SOX11-F：5′-CGTGCTGGTACCGCCACCATGGACTAC-3′，SOX11-R：5′-ACGATGATATGGTGCAGCAGGCCGAGA-3′；GAPDH-F：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，GAPDH-R：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.5 免疫組織化學(xué)

組織切片包埋及脫蠟、脫缸、微波熱抗原修復(fù)、37℃室溫下過氧化氫封閉、孵一抗(SOX11)并于4℃搖床過夜；第二天孵育二抗(室溫下2 h)、DAB顯色、染核、封片鏡檢等。病理評分標(biāo)準(zhǔn)[19]：兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。按染色深淺進(jìn)行評分：無陽性染色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細(xì)胞百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后二者相乘，0～4分為低表達(dá)，4～12分為高表達(dá)。

1.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞消化離心后計數(shù)：分別取實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞 3 000個/100 μL DMEM 培養(yǎng)液加入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)約24 h，每孔接種100 μL的細(xì)胞懸液。檢測前2 h在各孔中分別加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)0、24、48和72 h時分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞增殖活性，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm 處檢測各孔的OD值，并繪制細(xì)胞生長曲線。所有的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

收集實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞，消化離心重懸后倒置顯微鏡下計數(shù)：取4×103細(xì)胞/孔分別種于 Transell 小室上室和下室，96孔板中加入800 μL DMEN培養(yǎng)液，放入細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取出小室，固定，亞甲藍(lán)染色，倒置顯微鏡下計數(shù)并評價細(xì)胞遷移能力。所有的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.8 Western blot

從上述細(xì)胞和臨床組織樣本中提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測，蛋白提取方法同文獻(xiàn)報道[18]。取40 μg/孔蛋白進(jìn)行凝膠電泳，常溫下將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2～3 h，加入一抗并于4℃冰箱封閉過夜。24 h后取出一抗室溫TBST液洗膜0.5 h后，二抗封閉液室溫下孵育2 h，洗膜顯色，Amersham成像儀曝光，并用 Quantity One 軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH之比來表示相對表達(dá)差異。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。癌與癌旁組織配對分析采用配對χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX11在食管癌組織中的表達(dá)

與癌旁組織相比，在食管癌組織中SOX11 mRNA表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1A)。與正常食管上皮組織相比，SOX11 mRNA表達(dá)在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1B)。同時免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，SOX11蛋白在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)；通過 IPP9.0 軟件進(jìn)一步分析 SOX11 蛋白表達(dá)光密度，與癌旁組織相比(0.361±0.038)，SOX11在食管癌中(0.115±0.041)光密度降低(t=15.372，P<0.001)(圖1C，D)。

圖1 SOX11 在食管癌組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of SOX11 at levels of mRNA and protein in esophageal cancer and adjacent tissuesNote：A.The mRNA expression of SOX11 was down-regulated in esophageal cancer and Normal tissue，P<0.001；B.The mRNA expression of SOX11 was down-regulated in esophageal cancer and adjacent tissues，P<0.001；C-D.The expression of SOX11 protein was down-regulated esophageal cancer and adjacent tissues.*** P<0.001，when compared with the adjacent tissues.

2.2 SOX11 蛋白表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

本研究中臨床患者中SOX11的蛋白表達(dá)下調(diào)與腫瘤分級(P=0.014)、T分期(P=0.036)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)均有關(guān)。與患者性別、年齡、組織分化及預(yù)后生存均無關(guān)(P>0.05)；進(jìn)一步提示SOX11作為重要的腫瘤相關(guān)基因參與食管癌的進(jìn)程(表1)。

表1 SOX11 蛋白表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系Table 1 The relationship between the expression of SOX11 protein and clinicopathological features of esophageal cancer

2.3 SOX11 基因表達(dá)對腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

與食管上皮細(xì)胞 HEEC 相比，SOX11 mRNA 在EC109、KYSE150、 KYSE410 和 KYSE510 中表達(dá)下調(diào)，在 EC109 細(xì)胞中表達(dá)最低(P<0.001)(圖2A)。因此本研究選擇表達(dá)最低的食管癌細(xì)胞EC109作為研究對象。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使 SOX11 表達(dá)下調(diào)的EC109 細(xì)胞恢復(fù)表達(dá)(P<0.001)(圖2B)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)SOX11基因48 h后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.001)(圖2C)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá) SOX11 基因后，細(xì)胞遷移水平受到抑制(P<0.001)(圖2D，E)。

2.4 SOX11 對 Wnt/β-catenin 信號通路的影響

研究顯示SOX 家族能通過 HMG域與 Wnt 因子相結(jié)合，參與調(diào)控 Wnt信號通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證 SOX11 對 Wnt/β-catenin 信號通路的影響及作用機(jī)制，通過qRT-PCR法和Western blot檢測過表達(dá) SOX11對active-β-catenin 及下游靶基因的影響。本結(jié)果顯示，過表達(dá) SOX11 蛋白后，active-β-catenin 及下游靶基因 c-Myc 的表達(dá)明顯受到抑制(P<0.001)；同時上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子相基因表達(dá)水平明顯受到抑制，過表達(dá) SOX11 后 Vimentin、N-cadherin 的蛋白和 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.001)，E-cadherin的蛋白和 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.001)(圖3)。

3 討論

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤，對患者健康危害嚴(yán)重，由于其致病的復(fù)雜性，很難在疾病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。通常多數(shù)確診患者在腫瘤中晚期失去最佳治療期的時機(jī)。食管癌的發(fā)病是一個多階段、多步驟的過程，由多種致病因素引起，常伴有細(xì)胞損害和細(xì)胞內(nèi)平衡紊亂。至今，食管癌的致病機(jī)制和研究進(jìn)展仍不完全清楚，需要進(jìn)一步研究。

圖2 SOX11 對細(xì)胞增殖和遷移的影響Figure 2 Effects of SOX11 on proliferation and migration of esophageal cancer cellsNote：A.The mRNA expression of SOX11 was down-regulated in esophageal cancer cells when compared to HEEC cells，***P<0.001；B.The over-expressed SOX11 in EC109 cells，***P<0.001；C.The proliferation ability in over-expressed SOX11 EC109 cells，***P<0.001；D-E.The invasion capacity in over-expressed SOX11 EC109 cells，***P<0.001(200×).

圖3 免疫蛋白質(zhì)印跡法檢測SOX11對WNT/β-catenin信號通路的影響Figure 3 SOX11 disrupted the WNT/β-catenin signaling pathwayNote：A.The expression of total β-catenin，active β-catenin and its downstream genes was examined in EC109 cells by Western blot；B.Quantitative analysis of protein bands，*** P<0.001；C.The mRNA expression of β-catenin and its downstream genes were examined in EC109 cells by RT-qPCR，*** P<0.001.

SOX11是一種核轉(zhuǎn)錄因子，屬于SOX家族中C族成員，位于染色體2p25.2區(qū)，包含編碼441個氨基酸組成的蛋白質(zhì)[20]。在大多數(shù)分化成熟組織中，SOX11的表達(dá)相對較低；而SOX11在胚胎發(fā)育中，如神經(jīng)發(fā)育以及四肢、面部和腎臟的發(fā)育起重要的作用[21]。在腦發(fā)育后期，SOX11在一些分化的腦神經(jīng)元中高表達(dá)，在腦發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[22]。近年來研究發(fā)現(xiàn)SOX11促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞及愈傷組織的骨化，促進(jìn)骨折愈合[23]。SOX11也被發(fā)現(xiàn)參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄調(diào)控、腫瘤微環(huán)境等生物學(xué)行為；同時作為重要的分子腫瘤標(biāo)記物預(yù)測腫瘤預(yù)后[11，24-25]。但SOX11在食管癌中作用機(jī)制尚未見報道和研究。

本研究檢測了 SOX11 在食管癌組織中的相對表達(dá)。結(jié)果顯示，與配對癌旁組織相比，SOX11 mRNA和蛋白在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)。與正常組織相比，SOX11 mRNA在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)，提示SOX11可能作為潛在的抑癌基因參與食管癌的進(jìn)程。進(jìn)一步分析SOX11表達(dá)與相關(guān)臨床病理特征關(guān)系，結(jié)果提示食管癌中 SOX11 蛋白表達(dá)與腫瘤分級、T分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)；而與患者性別、年齡、組織分化及預(yù)后均無關(guān)。為證實(shí)SOX11是否為功能性的抑癌基因參與食管癌的進(jìn)程，本研究發(fā)現(xiàn)恢復(fù)表達(dá) SOX11 能抑制食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞增殖和遷移，為明確 SOX11 抑制食管癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，半定量PCR和免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) SOX11 后的EC109細(xì)胞，active-β-catenin及下游的轉(zhuǎn)移因子c-Myc的表達(dá)下調(diào)；同時上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子表達(dá)水平明顯受到抑制。與前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報道相一致[11-15]。

綜上所述，本研究SOX11基因在食管癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá) SOX11 后能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控食管癌的進(jìn)展。但SOX11基因能否作為食管癌診斷、治療和判斷預(yù)后的分子靶點(diǎn)，尚需要進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。