CRISPR技術(shù)在生物學(xué)與醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

楊悅 高郡茹 楊柳

（1. 廣西師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，桂林 541004；2. 廣西師范大學(xué)干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004；3. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541004）

1 CRISPR技術(shù)簡介

CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associate）是微生物體內(nèi)基于RNA介導(dǎo)的核酸酶切割清除外源核酸的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)［1］。與人體自身的免疫系統(tǒng)相似，微生物體內(nèi)的免疫需要經(jīng)歷適應(yīng)（感染）→表達(dá)（防御/切割）→插入（記憶）3個(gè)過程［2］。這3個(gè)過程主要由CRISPR系統(tǒng)完成，其中“表達(dá)”過程中會(huì)產(chǎn)生多種Cas蛋白。Cas1和Cas2負(fù)責(zé)將外源基因整合到CRISPR陣列中，Cas4負(fù)責(zé)對(duì)外源基因形成免疫記憶［3］，Cas9則在RNA引導(dǎo)下對(duì)外源核酸進(jìn)行切割。根據(jù)Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為5類，I、III和IV型系統(tǒng)均需要借助復(fù)雜的蛋白復(fù)合體，而II和V型系統(tǒng)僅需要RNA和Cas蛋白。大多數(shù)CRISPR系統(tǒng)都依賴于鄰近c(diǎn)rRNA靶向位點(diǎn)的PAM（Protospacer adjacent motif）序列，缺失PAM序列將會(huì)導(dǎo)致CRISPR系統(tǒng)的自我切割［3］。

基因編輯中最常用的CRISPR/Cas9屬于II型CRISPR系統(tǒng)，由Cas9蛋白和特異性選擇CRISPR RNA（crRNA）和輔助反式激活crRNA（tracrRNA）組成［4］。其中crRNA與tracRNA的結(jié)合體可被重新設(shè)計(jì)為包含Cas9結(jié)合和DNA靶位點(diǎn)特異性識(shí)別的單個(gè)轉(zhuǎn)錄物（single-guide RNA，sgRNA），在sgRNA協(xié)助下，Cas9蛋白可切割DNA上可被引物RNA識(shí)別并包含PAM（NGG序列）序列的位點(diǎn)［5］。相較于第一、二代基因編輯技術(shù)——ZFN和TALEN，CRISPR操作簡便，設(shè)計(jì)簡單，識(shí)別不受基因組甲基化的影響，近乎可以靶向任意細(xì)胞的任意序列，同時(shí)靶向多個(gè)位點(diǎn)，編輯效率更高。

2 CRISPR系統(tǒng)的改造與開發(fā)

2.1 DNA編輯

目前較成熟的兩種CRISPR系統(tǒng)為II型Cas9和V型Cpf1（原Cas12a）。2018年2月，David Liu實(shí)驗(yàn)室利用PACE（Phage-assisted continuous evolution）技術(shù)對(duì)spCas9蛋白進(jìn)行快速進(jìn)化和篩選，獲得了PAM序列兼容性更高、脫靶率更低的spCas9變體，命名為 xCas9 3.7［6］。相對(duì)之前的 spCas9，xCas9 3.7不僅具有更高的DNA特異性，且在所有NGG靶向測試中的脫靶率更低，在非NGG PAM靶向測試中也有著極低的脫靶率。這一發(fā)現(xiàn)打破了之前對(duì)Cas9的編輯效率、PAM序列兼容性和DNA靶向精確性三者之間相互制衡的認(rèn)知，擴(kuò)大了CRISPR系統(tǒng)的DNA靶向范圍，提高了基因編輯的準(zhǔn)確性和靈活性。此外，中科院動(dòng)物研究所李偉研究組在酸性脂環(huán)酸芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了另一種 Cas12b（AaCas12b）［7］。雖然AaCas12b的RuvC結(jié)構(gòu)域與Cas9和Cas12a相似，但其推定的Nuc結(jié)構(gòu)域與Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域和Cas12a的Nuc結(jié)構(gòu)域沒有序列或結(jié)構(gòu)相似性。相較于spCas9和Cfp1，AaCas12b具有尺寸更小、適用于包裝腺病毒、能識(shí)別更簡單的PAM序列、在人類血漿中穩(wěn)定性增強(qiáng)、脫靶效應(yīng)最低、特異性高等特點(diǎn)。相較Cas12b的最佳剪切溫度（40-55℃），AaCas12b的最適活性溫度為31-59℃，更適應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯。

2018年 10月，Doudna團(tuán)隊(duì)［8］發(fā)現(xiàn)了一套來自野生型古生菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中包含Cas14—一個(gè)異常緊湊的RNA引導(dǎo)的核酸家族［8］。對(duì)比分子較大的Cas9蛋白（950-1 400 aa），Cas14a蛋白的分子量更小（400-700 aa），并能在RNA介導(dǎo)下對(duì)無限制性序列的單鏈DNA進(jìn)行靶向切割。Cas14蛋白的小尺寸及其與V型Cas蛋白的相似性表明RNA介導(dǎo)的ssDNA切割可能先于第二類CRISPR系統(tǒng)出現(xiàn)，且可能第二類CRISPR系統(tǒng)正是由其發(fā)展而來。Cas14的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了微生物體內(nèi)CRISPR系統(tǒng)的多樣性，同為CRISPR系統(tǒng)，Cas9和Cpf1等主要作用于dsDNA，而Cas14等主要作用于ssDNA，為微生物抵抗外源病毒的侵襲提供了多樣的免疫方式。對(duì)此類微生物的進(jìn)一步探索有助于加強(qiáng)對(duì)微生物免疫“軍備競賽”的了解，也為發(fā)現(xiàn)更多有價(jià)值的CRISPR系統(tǒng)提供了線索。

2019年1月，Doudna團(tuán)隊(duì)［9］揭示了新型基因編輯工具CRISPR/CasX的潛在機(jī)制，該工具使用獨(dú)特的結(jié)構(gòu)進(jìn)行可編程的雙鏈DNA結(jié)合和切割。生化分析和細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明CasX對(duì)大腸桿菌和人類的基因組具有修飾活性。CasX蛋白的結(jié)構(gòu)和大小以及最小的反式切割活性表明這是一個(gè)與Cas9和Cas12a完全不同的、全新的Cas蛋白家族。研究證明，CasX是一種由RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，可在sgRNA介導(dǎo)下對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行切割。CasX蛋白大小緊湊，不到1 000 aa，更容易包裝入AAV病毒，為基因治療的體內(nèi)遞送提供了更高效的可能性；且CasX來源自非病原微生物，因此也更安全。

2016年，David實(shí)驗(yàn)室［10］利用失活的Cas蛋白與APOBEC1（胞苷脫氨酶1）共表達(dá)，開發(fā)了單堿基編輯系統(tǒng)（Base Editor，BE），可在不對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割的條件下完成單堿基（C→T）的永久突變。這種單堿基編輯系統(tǒng)中的dCas9保留了其在sgRNA介導(dǎo)下定位到DNA靶位點(diǎn)的能力，但不會(huì)對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行剪切，共表達(dá)的胞苷脫氨酶將目標(biāo)胞苷直接轉(zhuǎn)化為尿苷，然后利用體內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制將尿嘧啶永久轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。由于體內(nèi)尿嘧啶糖基化酶的作用，第一代BE的編輯效率較低。研究者在其基礎(chǔ)上融合了尿嘧啶糖基化酶抑制劑，開發(fā)出第二代BE，進(jìn)而融合了針對(duì)未編輯鏈的Cas9切口酶，以促進(jìn)DNA的修復(fù)反應(yīng)，形成第三代BE。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，研究人員通過篩選融合不同突變型的胞苷脫氨酶，將BE3的編輯窗口由5個(gè)縮窄至1-2個(gè)，并能夠區(qū)分相鄰的胞嘧啶，使之優(yōu)先糾正與疾病相關(guān)的目標(biāo)胞嘧啶的效率增加一倍［11］。經(jīng)過實(shí)踐觀察，2017年，實(shí)驗(yàn)者在BE3的基礎(chǔ)上融合共表達(dá)噬菌體Mu蛋白Gam，開發(fā)出BE4［12］。實(shí)驗(yàn)證明，BE4的編輯效率較BE3提升50%，且由于Gam能夠與DSB結(jié)合，錯(cuò)配率進(jìn)一步降低，編輯副產(chǎn)物減少一半。

BE系統(tǒng)中的dCas9主要識(shí)別的PAM序列為NGG形式，使之在富T序列中的編輯效率較低。針對(duì)此類問題，上?？萍即髮W(xué)的陳佳團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了以CRISPR/Cpf1為基礎(chǔ)的單堿基編輯系統(tǒng)［13］。Cpf1蛋白可識(shí)別富含A/T的PAM序列，結(jié)合了Cpf1的單堿基編輯系統(tǒng)在A/T富集區(qū)域亦可實(shí)現(xiàn)編輯作用，在擴(kuò)展了可編輯范圍的同時(shí)，產(chǎn)生的編輯副產(chǎn)物也較低，因此具有更高的編輯精確度。這種單堿基編輯器可與BE系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)堿基編輯的有效互補(bǔ)。由于BE系統(tǒng)僅在C→T堿基編輯中有較高效率，而A→G堿基編輯效率低。因此，David Liu團(tuán)隊(duì)將一種RNA腺苷脫氨酶與dCas9融合共表達(dá)，開發(fā)了腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor，ABEs）［14］。ABEs系統(tǒng)與BE系統(tǒng)原理相似，在RNA腺苷脫氨酶作用下將目標(biāo)腺嘌呤脫氨形成肌苷，再在聚合酶作用下轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤。與BE系統(tǒng)相比，ABEs系統(tǒng)引入點(diǎn)突變的效率更高、錯(cuò)配率低、編輯產(chǎn)物純度更高、副產(chǎn)物更少、對(duì)非靶基因的影響也更少［14］。

2.2 RNA編輯

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a能夠切割細(xì)菌的特定RNA序列。Doudna團(tuán)隊(duì)亦報(bào)道證實(shí)，CRISPR/Cas13a可用于RNA檢測［15］。2017年10月，張鋒實(shí)驗(yàn)室首先證實(shí)CRISPR/Cas13a可靶向編輯哺乳動(dòng)物體內(nèi)RNA。比起RNAi，Cas13a有著更強(qiáng)的特異性，并且由于其對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言是非內(nèi)源性的，因此擾亂細(xì)胞中天然的轉(zhuǎn)錄后網(wǎng)絡(luò)的可能性極低［16］。Hsu團(tuán)隊(duì)通過生化表征和蛋白質(zhì)工程對(duì)7種不同的直系同源物進(jìn)行分析篩選出Rosenococcus flavefaciens的 XPD3002（CasRx）［17］。并利用 HEPN 結(jié)構(gòu)失活的dCasRx靶向剪切前mRNA順式元件，在額顳葉癡呆神經(jīng)元模型中成功糾正了失調(diào)的tau蛋白異構(gòu)體比例。由于CasRx的尺寸較小，更易包裝入病毒載體應(yīng)用于治療。且相較于傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)，CasRx擁有較高的剪輯效率和精確性，不易產(chǎn)生明顯的脫靶效應(yīng)。據(jù)研究估計(jì)，RNA拼接錯(cuò)誤疾病占遺傳疾病的15%［18］。CasRx等RNA編輯蛋白的出現(xiàn)展現(xiàn)出了其在RNA多重靶向上的潛力。此外，靶向AAV遞送CasRx至特定的有絲分裂后細(xì)胞類型（如神經(jīng)元）中，則具有介導(dǎo)糾正單元的長期表達(dá)的潛力，避免了永久性遺傳修飾或糾正技術(shù)的頻繁施用，對(duì)其他核酸靶向技術(shù)進(jìn)行了補(bǔ)足，使核酸編輯技術(shù)得到了極大的擴(kuò)展［17］。

2.3 CRISPR的負(fù)面效應(yīng)

CRISPR技術(shù)發(fā)展迅速，然而其對(duì)目標(biāo)DNA的匹配有一定的容忍度，即可允許個(gè)別堿基的錯(cuò)配，這一特點(diǎn)導(dǎo)致Cas蛋白也會(huì)切割與目標(biāo)DNA有較少堿基差別的非目標(biāo)DNA，這一現(xiàn)象被稱為脫靶效應(yīng)［19］。脫靶效應(yīng)是CRISPR技術(shù)臨床應(yīng)用的最大挑戰(zhàn)。除此之外，也有研究顯示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)似乎在編輯p53基因突變的細(xì)胞時(shí)擁有更高的編輯效率［20］，而作為已知最重要的抑癌基因之一，p53的突變會(huì)使細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)增高［21］。更嚴(yán)重的是，法國波爾多大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯會(huì)誘導(dǎo)出現(xiàn)百萬堿基規(guī)模的染色體大片缺失，而這種缺失，比起脫靶效應(yīng)更為嚴(yán)重［22］。還有研究顯示，當(dāng)被CRISPR/Cas9編輯后的細(xì)胞進(jìn)行自身修復(fù)時(shí)，會(huì)在靶位點(diǎn)出現(xiàn)的大片缺失和更復(fù)雜的基因重排［23］。在此之前，對(duì)所有CRISPR基因編輯結(jié)果的分析，通常只關(guān)注靶點(diǎn)的鄰近序列以及遠(yuǎn)端的脫靶序列周圍很小的部分，并由此得出的CRISPR-Cas9精確特異性的結(jié)論。通過長讀取測序和長鏈PCR基因分型顯示，sgRNA/Cas9介導(dǎo)的DNA斷裂會(huì)導(dǎo)致許多一千以上堿基的缺失。此外，還發(fā)現(xiàn)了切割位點(diǎn)遠(yuǎn)端的突變和交叉事件［23］。在臨床同時(shí)編輯數(shù)十億細(xì)胞的情況下，產(chǎn)生的大量突變可能導(dǎo)致每例治療方案中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞攜帶致命突變。進(jìn)而導(dǎo)致癌變和腫瘤的形成。不過幸運(yùn)的是，Kim等［24］開發(fā)的用于體外檢測CRISPR脫靶效應(yīng)的工具——Digenome-seq的檢測結(jié)果和高彩霞團(tuán)隊(duì)［25］的研究均顯示，經(jīng)過精準(zhǔn)設(shè)計(jì)的sgRNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶率極低。

比起經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，BE系統(tǒng)擁有諸多優(yōu)點(diǎn)，且已有研究者在治療遺傳性疾病中利用該系統(tǒng)取得了一定的治療成果［26-27］。然而，中科院遺傳與發(fā)育研究所的高彩霞研究組通過對(duì)BE3、HF1-BE3與ABE單堿基編輯器的特異性進(jìn)行全基因組水平評(píng)估，全面分析比較了這3種單堿基編輯器系統(tǒng)在基因組水平上的的脫靶效應(yīng)。結(jié)果表明，無論是否有sgRNA的引導(dǎo)，BE3和HF1-BE3均可在水稻基因組中造成大量的單核苷酸變異（SNVs），且大部分為C＞T類型的堿基突變［25］。同時(shí)，楊輝團(tuán)隊(duì)建立了一種命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術(shù)，并用該技術(shù)檢測單堿基編輯的脫靶效應(yīng)，得到了與前者一致的結(jié)果［28］。GOTI的檢測顯示，BE3的脫靶效應(yīng)非常嚴(yán)重，但之所以之前的方法一直未能發(fā)現(xiàn)這一問題，是因?yàn)檫@些脫靶大多出現(xiàn)在傳統(tǒng)脫靶預(yù)測認(rèn)為不太可能出現(xiàn)的脫靶位點(diǎn)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，脫靶位點(diǎn)有部分出現(xiàn)在原癌基因和抑癌基因上，介于此類隱患，研究者認(rèn)為BE3并不適合作為臨床治療工具［28］。雖然CBE系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)令人擔(dān)憂，值得欣慰的是，不論是高彩霞研究組的研究還是GOTI的檢測，都顯示ABE系統(tǒng)依舊擁有極高的特異性。但也有研究認(rèn)為ABE系統(tǒng)并不如想象中的那么保險(xiǎn)，經(jīng)中山大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的首個(gè)檢測ABE系統(tǒng)全基因組范圍內(nèi)脫靶效應(yīng)的方法——EndoV-seq檢測顯示，ABE系統(tǒng)雖然特異性非常高，但仍然具有脫靶效應(yīng)［29］。而Jin-Soo Kim的研究則顯示，ABE系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)雖低于Cas9，卻高于BE3［30］。

具備無需DNA雙鏈斷裂和極低的錯(cuò)配率等優(yōu)點(diǎn)，單堿基編輯系統(tǒng)的高效性和低風(fēng)險(xiǎn)性使其在單點(diǎn)突變導(dǎo)致的遺傳病的治療中擁有極大地應(yīng)用潛力。但基于上述研究，單堿基編輯系統(tǒng)在投入臨床之前還需要進(jìn)行進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，應(yīng)通過優(yōu)化sgRNA序列、CRISPR核酸復(fù)合物遞送和優(yōu)化Cas9蛋白等方式［30］提升CBE和ABE系統(tǒng)的精確性。并且在利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行臨床應(yīng)用之前，對(duì)患者細(xì)胞進(jìn)行全面基因組分析，確定其具有正常的基因組，以降低治療風(fēng)險(xiǎn)［23］。

3 CRISPR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

3.1 構(gòu)建模型生物

2017年3月，韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所的研究人員利用CRISPR技術(shù)成功構(gòu)建單核苷酸編輯小鼠［31］。IBS的研究人員使用BE技術(shù)在小鼠胚胎中高效誘導(dǎo)堿基替換，從而培育出具有疾病表型的小鼠，為囊性纖維化、鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥、苯丙酮尿癥等單堿基突變引起的疾病提供了有效模型。2018年3月，暨南大學(xué)李曉江課題組利用CRISPR技術(shù)成功建立亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬模型［32］。作為神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域的里程碑式的發(fā)現(xiàn)，亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬的建立為深入了解神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制及尋找有效的理療方法提供了極佳的動(dòng)物模型。2019年2月，李曉江課題組再次利用CRISPR技術(shù)成功構(gòu)建了PINK1基因突變的帕金森恒河猴模型［33］。PINK1突變猴中觀察到的顯著神經(jīng)元丟失未在PINK1敲除小鼠或豬模型中報(bào)告，而這一現(xiàn)象可能與PINK1在靈長類動(dòng)物體內(nèi)的特異性表達(dá)和功能有關(guān)。PINK1突變猴的構(gòu)建揭示了PINK1在靈長類大腦中的關(guān)鍵功能，并將提供一個(gè)新的研究PINK1的多種功能和與PINK1功能障礙相關(guān)的發(fā)病機(jī)制的工具［33］。

3.2 監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)進(jìn)程

科學(xué)家們一直致力于尋找一種可觀察和記錄細(xì)胞生命活動(dòng)的方法但收效甚微。2017年12月，哥倫比亞大學(xué)的研究人員將CRISPR改造成“錄音筆”以記錄生物體內(nèi)轉(zhuǎn)瞬即逝的生理信號(hào)［34］。長期以來，人們大多關(guān)注于CRISPR強(qiáng)大的基因編輯功能，而忽略了其原本是一種來源于細(xì)菌的免疫機(jī)制。在細(xì)菌里，CRISPR-Cas系統(tǒng)能把外來病毒的DNA片段切斷，并整合到自己的CRISPR位點(diǎn)中，形成免疫記憶。因此，當(dāng)再有同樣的病毒入侵時(shí)，細(xì)菌就能根據(jù)CRISPR位點(diǎn)中的免疫記憶快速地、有針對(duì)性地啟動(dòng)防御?；谠撛?，研究者構(gòu)建了兩種質(zhì)粒，一種質(zhì)粒能夠?qū)ν鈦淼奶匦陨硇盘?hào)做出反應(yīng)，并隨之?dāng)U增；另一種質(zhì)粒則能表達(dá)CRISPRCas系統(tǒng)元件。根據(jù)設(shè)想，當(dāng)沒有外來生理信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，CRISPR表達(dá)質(zhì)粒會(huì)不斷地向細(xì)菌的CRISPR位點(diǎn)插入空白序列；當(dāng)有外來信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，前一種質(zhì)粒就會(huì)啟動(dòng)并擴(kuò)增，在CRISPR位點(diǎn)上留下印記。經(jīng)過一段時(shí)間后，對(duì)細(xì)菌的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行測序和分析，就能知道是否有監(jiān)控所需的生理信號(hào)。根據(jù)印記所在位置還能夠反推該信號(hào)產(chǎn)生的時(shí)間。這一設(shè)想已通過實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，研究者表示，這套系統(tǒng)在大腸桿菌中可以同時(shí)記錄了三種不同的生理信號(hào)，并持續(xù)記錄數(shù)天。2018年2月，美國布羅德研究所的Weixin Tang和David R. Liu共同開發(fā)出一種稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multievent recording apparatus）的CRISPR介導(dǎo)的模擬多時(shí)間記錄裝置，并利用這種技術(shù)構(gòu)建出兩種類型的細(xì)胞記錄系統(tǒng)——CAMERA 1和CAMERA 2［35］。在CAMERA 1中，研究人員將兩種不同的質(zhì)粒注入細(xì)菌細(xì)胞中，在刺激物誘導(dǎo)下，利用CRISPR Cas9切割其中一種質(zhì)粒，以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生另一種質(zhì)粒來取代之前的質(zhì)粒，由此完成對(duì)整個(gè)事件進(jìn)行記錄。這種記錄系統(tǒng)能夠幫助研究人員記錄細(xì)胞如何對(duì)營養(yǎng)物或抗生素等刺激物做出反應(yīng)。而在CAMERA 2中，當(dāng)所需的信號(hào)在細(xì)胞中發(fā)生時(shí)，研究人員利用堿基編輯器改變遺傳密碼中的單個(gè)堿基。由此可記錄當(dāng)細(xì)胞接觸病毒、營養(yǎng)物和抗生素等刺激物時(shí)，細(xì)胞如何作出反應(yīng)。據(jù)報(bào)道稱，研究人員已將該技術(shù)成功應(yīng)用于細(xì)菌細(xì)胞和人細(xì)胞中。此外，2018年4月，Spanjaard等［36］開發(fā)了利用CRISPR技術(shù)誘導(dǎo)的DNA瘢痕序列追蹤細(xì)胞譜系的技術(shù)，并命名為 LINNAEUS（Lineage tracing by nuclease-activated editing of ubiquitous sequence，通過對(duì)普遍存在的序列進(jìn)行核酸酶激活的編輯來開展譜系追蹤）。這種技術(shù)基于DNA中的瘢痕序列，當(dāng)這些瘢痕序列匯總在一起時(shí)就像條形碼一樣，能夠確定細(xì)胞的譜系。

3.3 疾病檢測及治療

CRISPR技術(shù)同樣可以用于癌癥、遺傳病、AIDS等疾病的檢測和治療。2017年11月，弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的研究人員將HS-AFM（高速原子力顯微鏡）與一種基于CRISPR的化學(xué)條形碼技術(shù)結(jié)合起來，開發(fā)出了一種新的納米繪圖技術(shù)［37］。他們用Cas9-sgRNA復(fù)合物標(biāo)記目標(biāo)DNA，然后用HS-AFM對(duì)目標(biāo)DNA成像并測定DNA上的標(biāo)記。由此可對(duì)腫瘤細(xì)胞中突變基因進(jìn)行精確定位并分析。由于該技術(shù)的要求設(shè)備占地小，且可直接用DVD光學(xué)元件檢測成像，因此有望在醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室中得到普及。2018年4月，來自斯坦福大學(xué)的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種修飾肺癌小鼠肺部的一對(duì)癌癥相關(guān)基因的新方法，之后還能精確地追蹤腫瘤中的每一個(gè)細(xì)胞［38］。他們將CRISPR/Cas9與DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合開發(fā)出了組合性技術(shù)，以此來追蹤癌癥的生長發(fā)展情況。這種技術(shù)能幫助研究者在實(shí)驗(yàn)室中復(fù)制出在癌癥患者體內(nèi)所觀察到的腫瘤的遺傳多樣性，也有助于研究者克服在研究癌癥復(fù)雜性中產(chǎn)生的畏難情緒。2017年2月，美國斯隆—?jiǎng)P特琳癌癥中心的研究人員使用腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)，將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于CAR-T療法［39］。研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建出更加強(qiáng)效的嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor CAR）T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞），從而增強(qiáng)小鼠體內(nèi)的腫瘤免疫排斥。這一發(fā)現(xiàn)揭示出CAR免疫療法的一些細(xì)節(jié)，并且突出展現(xiàn)了利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)推動(dòng)癌癥免疫療法的潛力。該研究避免了傳統(tǒng)CAR-T療法的隨機(jī)整合可能存在的潛在危害，也極大地降低了CAR-T細(xì)胞發(fā)生分化或癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

2019年2月，Natrue Medicine上發(fā)表了針對(duì)早衰癥和杜氏肌營養(yǎng)不良癥的CRISPR基因治療成果。早衰癥是由于LMNA基因發(fā)生突變，導(dǎo)致一個(gè)選擇性前體mRNA（pre-mRNA）剪接位點(diǎn)被激活，并表達(dá)progerin（一種缺失50個(gè)氨基酸的lamin A蛋白突變體）引發(fā)的一種遺傳病。Progerin在核膜上的積累會(huì)損害核結(jié)構(gòu)的完整性、異染色質(zhì)維持、DNA修復(fù)和氧化還原穩(wěn)態(tài)，并促進(jìn)細(xì)胞衰老。針對(duì)早衰癥的致病機(jī)理，西班牙和美國的研究團(tuán)隊(duì)［40］開發(fā)了相應(yīng)的CRISPR/Cas9治療策略——通過破壞LMNA基因的最后部分，在不影響lamin C表達(dá)的情況下，阻礙lamin A/progerin的生成。出于安全性和廣泛的組織親和性，研究者選擇AAV 9作為遞送載體，分別通過腹腔注射或靜脈注射注入早衰癥小鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過CRISPR/Cas9治療的小鼠中的progerin蛋白顯著減少，平均壽命延長25%以上。杜氏肌營養(yǎng)不良癥是一種發(fā)病率相對(duì)較高的，由X染色體上編碼抗肌萎縮蛋白基因（Dystrophin）突變所致的單基因疾病。Gersbach團(tuán)隊(duì)通過CRISPR技術(shù)直接刪除dystrophin基因突變位點(diǎn)附近的堿基，使之表達(dá)縮短版的抗肌萎縮蛋白，以此恢復(fù)部分肌肉能力［41］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過靜脈單次注射AAV 8裝載的CRISPR后，基因組編輯效果在肌營養(yǎng)不良癥小鼠模型體內(nèi)可持續(xù)長達(dá)一年的時(shí)間，且在此間抗肌萎縮蛋白表達(dá)的恢復(fù)得以維持［41］。

2018年4月，郭斐團(tuán)隊(duì)報(bào)道稱，已使用CRISPR/Cas9技術(shù)成功抑制了艾滋病病毒HIV-1的多個(gè)感染步驟［42］。研究者在文章中進(jìn)一步探討了CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染的分子機(jī)制——Cas9不僅在病毒DNA中導(dǎo)致插入缺失，并且降低了晚期病毒DNA產(chǎn)物和整合病毒DNA的水平。實(shí)驗(yàn)還表明，只有當(dāng)Cas9存在于細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，才能對(duì)新合成的HIV-1 DNA進(jìn)行編輯，并抑制病毒的感染。

4 小結(jié)

伴隨著CRISPR技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的廣泛使用，并與多種傳統(tǒng)的研究技術(shù)相結(jié)合，其在癌癥的治療和遺傳性疾病方面的應(yīng)用取得多項(xiàng)喜人的研究成果。而同時(shí)，雖然相較于第一代和第二代基因編輯技術(shù)，CRISPR技術(shù)在精確性和特異性上均有極大提升且更易操作，但脫靶效應(yīng)仍是其大規(guī)模應(yīng)用于基因治療的主要掣肘，因此，如何降低脫靶率，提高精確性、特異性和穩(wěn)定性依然是CRISPR技術(shù)急需解決的問題。盡管如此，作為具備眾多優(yōu)點(diǎn)的新一代基因編輯技術(shù)，CRISPR技術(shù)在科學(xué)研究中的發(fā)展應(yīng)用依然值得我們期待。