四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 技術(shù)及其在動(dòng)植物遺傳育種研究中的應(yīng)用

余鈞劍 遲美麗 賈永義 劉士力 竺俊全 顧志敏

（1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211；2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，湖州 313001）

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA 序列中單個(gè)堿基的變化，包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失［1］，是繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）后的第3 代分子標(biāo)記。SNP 標(biāo)記具有突變位點(diǎn)數(shù)目多、遺傳穩(wěn)定性高、有利于實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)［2］，因此被廣泛應(yīng)用遺傳育種領(lǐng)域［1-3］。目前 SNP 的檢測(cè)方法大致可以分為兩大類：一大類是以單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DDGE）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）、等位基因特異性 PCR（AS-PCR）等為代表的以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)方法；另一大類是以直接測(cè)序、DNA 芯片、變性高效液相色譜（DHPLC）、質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)、高分辨率熔解曲線（HRM）等為代表的高通量、自動(dòng)化程度較高的檢測(cè)方法［4-5］。總體上，前者傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)設(shè)備要求不高，投入成本低，但速度慢，很難實(shí)現(xiàn)高通量的 SNP 檢測(cè)；而后者的檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn) SNP 高通量、自動(dòng)化檢測(cè)，但對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求高，成本很高。四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 技術(shù)是一種基于TaqDNA 聚合酶對(duì)位于引物3′末端堿基錯(cuò)配無(wú)法修復(fù)，在普通PCR 基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)4個(gè)特異性的引物和優(yōu)化擴(kuò)增條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP 位點(diǎn)單管PCR 分型的檢測(cè)技術(shù)［6］，具有操作簡(jiǎn)便、快速、能對(duì)SNP 進(jìn)行分型、以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。本文詳細(xì)介紹了四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 的技術(shù)原理、優(yōu)勢(shì)、結(jié)果檢測(cè)手段和反應(yīng)體系改進(jìn)方法，綜述了該技術(shù)在遺傳育種研究中的應(yīng)用，為該技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇以及分子設(shè)計(jì)育種等領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)原理

四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 簡(jiǎn)稱四引物擴(kuò)增法［7］，又被稱為兩對(duì)交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）［8］、 單 管雙向等位基因?qū)Ｒ恍詳U(kuò)增（Single-tube bi-directional allele specific amplification，SB-ASA）［9］和雙向PCR擴(kuò)增特異等位基因（Bidirectional PCR amplification of specific alleles，Bi-PASA）［10］。該方法是Ye 等［7］在2001 年將Tetra-primer PCR 和ARMS 法結(jié)合，以單管PCR 反應(yīng)為基礎(chǔ)，用以檢測(cè)DNA 中點(diǎn)突變的基因分型新方法。Tetra-primer ARMS PCR 是在等位基因特異性PCR（Allele specific PCR，AS-PCR）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的［11］，因此其基本原理相類似：在PCR 反應(yīng)起始過程中，如果引物3′末端堿基與模板鏈上堿基按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則反向互補(bǔ)，則延伸反應(yīng)能正常進(jìn)行，PCR 產(chǎn)物中有該引物相對(duì)應(yīng)的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。反之，如果引物3′末端堿基發(fā)生錯(cuò)配，基于TaqDNA 聚合酶對(duì)位于引物3′末端堿基錯(cuò)配無(wú)法修復(fù)，延伸反應(yīng)不能正常進(jìn)行，新鏈延伸速度低于上述引物3′末端堿基與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)的延伸反應(yīng)［12］。當(dāng)錯(cuò)配堿基數(shù)目達(dá)到一定程度，3′末端錯(cuò)配的堿基與模板鏈間的磷酸二酯鍵形成受阻，擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)法發(fā)生，PCR 產(chǎn)物中沒有該引物相對(duì)應(yīng)的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物［13］。因此，可以根據(jù)PCR 結(jié)果能否得到特異長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶，確定模板DNA 上是否具有與引物3′末端相應(yīng)的突變。

Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)需要根據(jù)其具體SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)4 條不同的引物，分別在SNP 位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)2 條內(nèi)引物（正向內(nèi)引物N1 和反向內(nèi)引物N2），在SNP 位點(diǎn)上下游不同距離（一般200-500 bp）分別設(shè)計(jì)2 條外引物（正向外引物W1 和反向外引物W2）。特異性內(nèi)引物N1 和N2 延伸方向相反，分別與SNP 位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因相對(duì)應(yīng)，其中正向內(nèi)引物N1 3′末端堿基與某一個(gè)的等位基因相同，反向內(nèi)引物N2 3′末端堿基與另一個(gè)等位基因互補(bǔ)。在此PCR 反應(yīng)體系中，正向外引物W1 和反向外引物W2 擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的對(duì)照片段，正向外引物W1 和反向內(nèi)引物N2 擴(kuò)增一條代表野生型（或代表突變型）的特異性片段，正向內(nèi)引物N1 和反向外引物W2 擴(kuò)增另外一條代表突變型（或代表野生型）的特異性片段。特異性內(nèi)引物用來(lái)檢測(cè)突變是否發(fā)生，外引物不但作為陽(yáng)性參照而且和特異性內(nèi)引物分別配對(duì)有選擇性地?cái)U(kuò)增突變型與野生型個(gè)體基因。通過特異性擴(kuò)增產(chǎn)物片段的有無(wú)和長(zhǎng)度大小，鑒定待測(cè)樣本是否為野生型、突變型或雜合型［11，14］。

2 Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)與常見SNP檢測(cè)方法的比較

Stephan 等［15］在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎致病基因LTA多態(tài)性的研究中比較了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RELP）技術(shù)、高分辨率熔解曲線（HRM）分析、Sanger 測(cè)序法和Tetra-primer ARMS PCR 四種檢測(cè)SNP 的方法，發(fā)現(xiàn)它們檢測(cè)結(jié)果一致。但是與PCR-RELP 技術(shù)相比，Tetra-primer ARMS PCR 不需要用特異性內(nèi)切酶消化切割PCR 產(chǎn)物，可以在PCR 完成后直接進(jìn)行下一步的電泳，簡(jiǎn)化了操作步驟，省去限制性內(nèi)切酶所需的檢測(cè)成本和消化時(shí)間，同時(shí)又避免酶切不完全所造成的假陽(yáng)性結(jié)果。而且PCR-RELP 僅僅只能夠檢測(cè)出位于酶切位點(diǎn)的SNP，Tetra-primer ARMS PCR 卻不受其限制。與HRM 相比，HRM 需通過飽和染料（如SYBRGreen、ResoLight、SYT09 等）對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行閉管檢測(cè)分析，但是要求檢測(cè)設(shè)備具有較高的升降溫速率及溫度均一性，若待檢測(cè)的DNA 片段GC 含量過高或SNP 位點(diǎn)過于集中，則無(wú)法進(jìn)行HRM 檢測(cè)。Tetra-primer ARMS PCR 對(duì)設(shè)備硬件的要求低，只需常規(guī)PCR 儀和電泳設(shè)備就可以操作。Sanger 測(cè)序是檢測(cè)SNP 位點(diǎn)最直接可靠的方法，具有較高的靈敏度［16］，但是檢測(cè)費(fèi)用較貴，操作繁瑣。關(guān)于Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)與其他常見SNP 檢測(cè)方法的比較，如ASPCR 對(duì)于某基因單個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)至少需要雙管反應(yīng)才能進(jìn)行SNP 分型，Tetra-primer ARMS PCR 將反應(yīng)集中到一個(gè)體系內(nèi)進(jìn)行，由于利用了引物間對(duì) DNA 模板的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，所以提高了檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度和特異性，同時(shí)簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，進(jìn)而節(jié)省一定時(shí)間和成本［7］。而Taqman 熒光探針法可以特異、快速、高效、自動(dòng)化地實(shí)現(xiàn)SNP 分型，但是由于探針的高費(fèi)用，導(dǎo)致檢測(cè)成本較高。目前大量研究證明通過設(shè)計(jì)4 條特異性引物進(jìn)行Tetra-primer ARMS PCR、電泳，在2-3 h 可以實(shí)現(xiàn)單管基因分型，檢測(cè)結(jié)果也與直接測(cè)序一致［17-18］。

因此與常見SNP 檢測(cè)技術(shù)相比，Tetra-primer ARMS PCR 操作簡(jiǎn)單快速、價(jià)格低廉，在具備常規(guī)PCR 條件的實(shí)驗(yàn)室都可以開展，易于推廣。但是該技術(shù)也有其局限性，如引物設(shè)計(jì)要求高、對(duì)于擴(kuò)增條件要求嚴(yán)格。因此如何設(shè)計(jì)SNP 位點(diǎn)特異性內(nèi)引物和如何改進(jìn)反應(yīng)條件獲得清晰條帶，對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用非常重要。

3 Tetra-primer ARMS PCR 反應(yīng)體系的改進(jìn)方法

Tetra-primer ARMS PCR 引物設(shè)計(jì)是決定該技術(shù)檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，其次反應(yīng)體系的優(yōu)化也能提高PCR 反應(yīng)的特異性，從而防止引物與靶DNA 配對(duì)時(shí)可能發(fā)生的錯(cuò)配延伸，出現(xiàn)假陽(yáng)性條帶。反應(yīng)體系通常從內(nèi)外引物濃度和比例、反應(yīng)溫度、靶DNA 濃度、TaqDNA 聚合酶的用量和種類以及Mg2+濃度等在幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)。

3.1 引入錯(cuò)配堿基

除了內(nèi)引物3′末端堿基必須落在突變的位置上，為提高擴(kuò)增的特異性和靈敏度，還可以在靠近內(nèi)引物3′端的位置人為地引入錯(cuò)配堿基，這樣對(duì)于匹配者有一個(gè)錯(cuò)配，而對(duì)于非匹配者則存在兩個(gè)錯(cuò)配，大大地減少了非特異擴(kuò)增。一般來(lái)說，人為錯(cuò)配堿基多位于引物 3′端倒數(shù)第二或三位。特異性高低還取決于堿基的錯(cuò)配類型，如果 3′端是高度不穩(wěn)定的錯(cuò)配（A/G、T/T 或C/T），則需要引入較弱的錯(cuò)配（C/A 或G/T）或不引入錯(cuò)配，反之亦然［19］。

3.2 內(nèi)外引物濃度和比例

內(nèi)外引物濃度和比例是優(yōu)化Tetra-primer ARMS PCR 反應(yīng)體系的重要方面。若引物濃度過高，會(huì)導(dǎo)致引物與模板的非特異性結(jié)合機(jī)率增大而出現(xiàn)假陽(yáng)性；若濃度過低則擴(kuò)增產(chǎn)物少條帶不清晰。Tetraprimer ARMS PCR 反應(yīng)4 個(gè)引物集中于一個(gè)體系內(nèi)進(jìn)行，引物間存在與DNA 模板的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，需要調(diào)節(jié)內(nèi)外引物比例提高檢測(cè)的特異性擴(kuò)增。Ye 等［7］認(rèn)為內(nèi)外引物濃度之比為10∶1 并結(jié)合Touchdown PCR 時(shí)的檢測(cè)靈敏性最高。鄭煒佳等［20］把內(nèi)外引物控制在4∶1 時(shí)得到較滿意的特異性條帶。姜樹朋等［17］發(fā)現(xiàn)在內(nèi)外引物之比為 1∶2 時(shí)特異性最好。所以不同的反應(yīng)體系內(nèi)外引物濃度和比例不同，一般來(lái)說，適當(dāng)增加內(nèi)引物濃度比例，可以增加特異性擴(kuò)增片段的擴(kuò)增量，提高檢測(cè)的靈敏度。另外，擴(kuò)增片段較長(zhǎng)的引物由于擴(kuò)增效率較低，需要適當(dāng)提高引物濃度。

3.3 退火溫度

Tetra-primer ARMS PCR 反應(yīng)中退火溫度越高，引物與模板的堿基互補(bǔ)結(jié)合越嚴(yán)格，擴(kuò)增特異性越好，但特異性產(chǎn)物的量將減少；反之退火溫度越低對(duì)特異性引物與模板的結(jié)合就越有利，但過低的退火溫度會(huì)使非特異性擴(kuò)增增多，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中一般在一定溫度范圍內(nèi)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的退火溫度［21-23］。

3.4 其他方法

熱啟動(dòng)TaqDNA 聚合酶可以提高PCR 的分型效果。Alyethodi 等［24］發(fā)現(xiàn)使用熱啟動(dòng)TaqDNA 聚合酶代替TaqDNA 聚合酶就能顯著提高特異性擴(kuò)增效率，反應(yīng)更靈敏。王瑞恒等［25］比較了TaqDNA聚合酶、ExTaqDNA 聚合酶以及熱啟動(dòng)ExTaqDNA聚合酶，發(fā)現(xiàn)熱啟動(dòng)ExTaqDNA 聚合酶的擴(kuò)增效果最好。TaqDNA 聚合酶的用量、靶DNA 濃度、Mg2+濃度以及dNTP 的濃度也會(huì)對(duì)擴(kuò)增的靈敏度和特異性產(chǎn)生影響，可以設(shè)定若干不同濃度進(jìn)行驗(yàn)證優(yōu)化［26-28］。此外，采用Touchdown PCR 可以顯著增加反應(yīng)的特異性［29-30］。

4 Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)檢測(cè)手段

最初，由于Tetra-primer ARMS PCR 擴(kuò)增的兩條特異性產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，實(shí)驗(yàn)者使用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)。近年來(lái)通過結(jié)合其他檢測(cè)設(shè)備、對(duì)引物進(jìn)行熒光標(biāo)記等方法，Tetra-primer ARMS PCR 的檢測(cè)手段也不斷改進(jìn)，操作步驟得以簡(jiǎn)化，靈敏度也越來(lái)越高。

4.1 Tetra-primer ARMS PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳

在傳統(tǒng)的 Tetra-primer ARMS PCR 中，擴(kuò)增產(chǎn)物一般直接應(yīng)用電泳來(lái)檢測(cè)。Tetra-primer ARMS PCR反應(yīng)中上游和下游引物到突變點(diǎn)距離不同，因此在電泳圖譜中得到大小不同的特異性譜帶。根據(jù) 3′末端特異性引物阻斷類型和電泳圖譜中譜帶大小以及有無(wú)，可以直接判斷個(gè)體的基因型。該方法具有簡(jiǎn)便快速、設(shè)備要求低及價(jià)格低廉等特點(diǎn)［26］，是該技術(shù)相對(duì)其他技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)所在。

4.2 Tetra-primer ARMS PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳

Vannucchi 等［31］在2006 年首次將Tetra-primer ARMS PCR 與毛細(xì)管電泳結(jié)合，并且成功檢測(cè)到酪氨酸激酶2（JAK2）基因的點(diǎn)突變。丁子軒等［32］在2018 年通過Tetra-primer ARMS PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳法對(duì)淋巴瘤患者 MYD88 基因 L265P 突變進(jìn)行分型，在PCR 反應(yīng)中，上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物的 5′端均用熒光基團(tuán)修飾，將 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過處理后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，MYD88 基因野生型和突變型分別在不同堿基序列長(zhǎng)度處出現(xiàn)特異性單峰峰圖。該方法將突變位點(diǎn)檢測(cè)靈敏度提高到約1%的突變比例，顯著高于傳統(tǒng)的直接測(cè)序法［31-34］。而且該方法通過設(shè)計(jì)長(zhǎng)度和熒光波長(zhǎng)不同的內(nèi)引物，對(duì)多個(gè)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增后混合上樣進(jìn)行毛細(xì)管電泳，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)［35］，進(jìn)一步減少檢測(cè)時(shí)間和試劑成本，如段素霞等［36］建立改進(jìn)的四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 檢測(cè)方法，結(jié)合QIAxcel 毛細(xì)管電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)單管一次性檢測(cè)葉酸代謝過程相關(guān)基因的4 個(gè)SNP 位點(diǎn)。

4.3 Tetra-primer ARMS PCR結(jié)合熔解曲線

除了以上電泳檢測(cè)手段，熔解曲線法也被應(yīng)用到Tetra-primer ARMS PCR 檢測(cè)過程中來(lái)。Liu 等［37］將四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 和熔解曲線技術(shù)相結(jié)合，在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)骨髓增生性腫瘤（MPNs）的分子標(biāo)志基因JAK2 的V617F 突變，準(zhǔn)確性為100%，分析靈敏度為1.25%。該方法要求將四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物按一定速率升溫變性，同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，繪制熔解曲線。當(dāng)存在突變時(shí)，就能得到不同的 PCR 產(chǎn)物，而不同片段長(zhǎng)度的 PCR 產(chǎn)物，就會(huì)形成不同 Tm 值的熔解曲線。根據(jù)熔解曲線波峰的多少和擴(kuò)增的特異性條帶所代表的堿基種類，就可以準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子、雜合子和突變性純合子。Baris 等［38］應(yīng)用此方法成功檢測(cè)出FV、PII、MTHFR 和FGFR3 基因中的常見突變，該方法不僅可以減少電泳檢測(cè)方法繁瑣的操作步驟，避免可能引起的污染，還具有低成本、高通量的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)于SNP 的研究越來(lái)越受到人們關(guān)注，與之相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)也得到了快速發(fā)展。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)手段設(shè)備要求低，一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的條件均可滿足該實(shí)驗(yàn)要求，價(jià)格也較低廉，容易推廣。而毛細(xì)管電泳和熔解曲線檢測(cè)手段對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求高，成本也較昂貴。與傳統(tǒng)檢測(cè)手段相比，Tetra-primer ARMS PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳大大提高檢測(cè)突變位點(diǎn)的靈敏度，還可定量檢測(cè)基因突變，準(zhǔn)確性接近實(shí)時(shí)定量PCR，通過一次電泳可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)。Tetra-primer ARMS PCR 結(jié)合熔解曲線技術(shù)則進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作步驟，將Tetra-primer ARMS PCR 反應(yīng)過程和結(jié)果檢測(cè)集中同一PCR 管。因此，小規(guī)模、靈敏度要求低的SNP 測(cè)序，可采用傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)手段，而毛細(xì)管電泳和熔解曲線檢測(cè)手段更適合準(zhǔn)確性高的高通量檢測(cè)。

5 Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)在動(dòng)植物遺傳育種研究中的應(yīng)用

5.1 構(gòu)建遺傳連鎖圖譜

遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建是對(duì)基因組進(jìn)行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)，也是動(dòng)植物遺傳育種的依據(jù)。利用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記控制重要經(jīng)濟(jì)性狀的基因，再利用定位克隆技術(shù)克隆這些基因，通過分子標(biāo)記輔助育種，結(jié)合常規(guī)育種方法對(duì)經(jīng)濟(jì)物種進(jìn)行遺傳改良，最終生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗逆的優(yōu)良品種［39］。SNP 分子標(biāo)記在基因組中非常豐富且突變率低，可用于構(gòu)建高精度的遺傳圖譜［40］。張建勇［41］以中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）F1 家系為作圖群體，利用Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序預(yù)測(cè)的單核苷酸突變進(jìn)行分型，構(gòu)建了具有200 個(gè)SNP 位點(diǎn)標(biāo)記的中國(guó)對(duì)蝦父母本的遺傳連鎖圖譜。張紫晉［42］設(shè)計(jì)38 對(duì)Tetra-primer ARMS PCR 引物對(duì)攜帶抗條銹病基因Yr41 的小麥抗病品種川農(nóng)19（CN19）進(jìn)行SNP 檢測(cè)，繪制出Yr41 基因的精細(xì)連鎖遺傳圖。因此，通過Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)檢測(cè)和開發(fā)的SNP 分子標(biāo)記具有較高的準(zhǔn)確性，可滿足遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建要求。

5.2 輔助選育和分子標(biāo)記開發(fā)

Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)物種中進(jìn)行過與生長(zhǎng)性狀相關(guān)研究。彭娜等［43］對(duì)中華鱉（Trionyx Sinensis）IGF2 基因中2 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分型，分型結(jié)果與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)系分析結(jié)果表明2 個(gè)SNP 位點(diǎn)具有用作中華鱉生長(zhǎng)性狀分子標(biāo)記輔助育種的潛力。Zhang 等［44］開發(fā)2 個(gè)與秦川肉牛（Bovine）ACADVL 基因相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，該基因?qū)η卮ㄈ馀５男貙?、胸深和髖寬有顯著影響，可以作為選擇秦川肉牛中具有優(yōu)良生長(zhǎng)性狀個(gè)體的DNA 標(biāo)記。在水稻中，研究者結(jié)合四引物擴(kuò)增受阻突變體PCR 的技術(shù)原理開發(fā)基因功能標(biāo)記，可準(zhǔn)確區(qū)分水稻高氮利用率NRT1.1B 基因的純合顯性、純合隱性和雜合基因型，可廣泛應(yīng)用于水稻NRT1.1B 基因的資源鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種［45］。在與繁殖性狀相關(guān)SNP 研究中，管峰等［46］建立一種BMPR-IB基因的Tetre-primer ARMS PCR 檢測(cè)方法，準(zhǔn)確判斷綿羊個(gè)體中這一控制多胎性狀的主效基因的基因型。Ahlawat 等［47］通 過Tetre-primer ARMS PCR 成 功 對(duì)黑孟加拉山羊（Capra aegagrus hircus）Fec 基因中鑒定的3 個(gè)新SNP 進(jìn)行了基因分型，確定該基因與黑孟加拉山羊生殖力相關(guān)。在與抗病性狀相關(guān)SNP 研究中，研究員分別建立了苦瓜［48］、辣椒［49］、牛［50］等抗病基因的Tetra-primer ARMS PCR 檢測(cè)方法。綜上所述，Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)可以作為一種非常有力的工具應(yīng)用于輔助選育，將極大推動(dòng)動(dòng)植物遺傳育種進(jìn)程。

5.3 品種鑒定

品種鑒定技術(shù)現(xiàn)已由傳統(tǒng)表型鑒定發(fā)展到分子標(biāo)記技術(shù)鑒定，SNP 分子標(biāo)記的應(yīng)用能夠?yàn)槠贩N鑒定提供準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)渠道。田孟祥等［45］針對(duì)水稻S5 基因設(shè)計(jì)Tetra-primer ARMS PCR 引物，能很好地對(duì)水稻秈粳屬性進(jìn)行區(qū)分，為利用秈粳雜種優(yōu)勢(shì)的親本有效選擇和秈粳分化研究提供重要參考。朱二勇［51］利用Tetra-primer ARMS PCR 對(duì)BMPR-IB基因分型研究中，開發(fā)用于策勒黑羊、多浪羊、湖羊以及中國(guó)美利奴羊（新疆型）品種特異性鑒定的SNP 分子標(biāo)記。姚姝等［52］通過開發(fā)水稻Pi-ta、Pi-b和Wx-mq 基因SNP 分子標(biāo)記對(duì)水稻品種南粳46、南粳5055 和南粳9108 進(jìn)行品種鑒定，并且成功進(jìn)行多基因聚合育種，選育出水稻新品系南粳0051。

6 小結(jié)

作為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，SNP 以其多態(tài)性豐富、在基因組中分布密度大等優(yōu)勢(shì)，在遺傳育種、物種親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)鑒定、種質(zhì)資源保存與管理、基因庫(kù)構(gòu)建等研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿Αetra-primer ARMS PCR 技術(shù)作為一種操作簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確性高、低成本的SNP 分型技術(shù)，應(yīng)用前景廣闊。目前，Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)的發(fā)展方向主要在于通過與其他檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，使得其可滿足大規(guī)模樣本檢測(cè)的要求、具有更高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)進(jìn)一步簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，降低成本。隨著SNP 分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展和Tetra-primer ARMS PCR 技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳育種研究，為實(shí)驗(yàn)者提供一種簡(jiǎn)便且成本低廉的SNP 分型手段。