乳品檢測技術(shù)中免疫分析法的研究進展與應(yīng)用

文/張紫薇 李光輝 倪麗麗 張君超

乳及乳制品富含豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)均衡且易于吸收[1]。研究表明，每人每天喝244-488g牛奶或酸奶可使心血管死亡率和中風(fēng)率下降23%和34%。因此，乳品在人類健康方面起到了關(guān)鍵作用，是我國重點發(fā)展行業(yè)之一。我國是產(chǎn)奶大國，乳品行業(yè)高速發(fā)展，乳品的產(chǎn)量和種類日漸豐富，在過去十幾年乳品質(zhì)量良莠不齊，從奶源的飼養(yǎng)環(huán)境、收奶環(huán)節(jié)、加工過程、產(chǎn)品儲存，運輸?shù)雀鱾€方面可能會受到抗生素、違禁添加、生物毒素、致病菌和菌落總數(shù)等多種風(fēng)險因子威脅。針對以上問題，我國尤其注重乳制品的安全檢測。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和市場監(jiān)督管理總局對乳品的檢測與監(jiān)測越來越嚴(yán)格，涉及到乳品加工與流通的各個環(huán)節(jié)。國家已頒布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)通過限量要求以保障乳品質(zhì)量安全。

為使老百姓放心的喝到真正的健康奶、優(yōu)質(zhì)奶，提高乳品安全檢測技術(shù)水平十分重要。目前，我國乳品領(lǐng)域檢測技術(shù)主要分為儀器分析法和免疫分析法。其中，特異性強、靈敏度高、簡便快捷、經(jīng)濟安全的免疫學(xué)方法在檢測乳品中的風(fēng)險因子中占有重要地位。本文根據(jù)不同檢測技術(shù)的特點及優(yōu)劣勢對其在乳品安全領(lǐng)域的應(yīng)用進行論述。

儀器分析技術(shù)概述

儀器分析法是我國檢測方法中的國家標(biāo)準(zhǔn)方法之一。目前，儀器檢測方法主要包括液相色譜法（LC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），LC可與多種檢測器結(jié)合使用，LC-MS/MS是兼分離、定性和定量的一種聯(lián)用技術(shù)，適用于復(fù)雜基質(zhì)中的確證分析。儀器分析法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、可用于多種危險因子同步檢測，但儀器購買和維護費用昂貴，對操作人員要求較高，不適宜現(xiàn)場大量樣本的快速檢測[2]。

樣品前處理是儀器法檢測技術(shù)的關(guān)鍵步驟，樣品前處理在整個儀器法檢測過程中耗時長，是該方法的主要誤差來源。在以往使用過程中，主要的凈化方法包括固相萃取、超臨界萃取、液-液分配等。傳統(tǒng)的凈化方法會存在本底干擾，耗時操作復(fù)雜，容易被污染等問題。因此，樣品前處理方法在檢測過程中起到十分重要的作用。近年來，免疫親和柱、多功能凈化柱和固相萃取柱在檢測前處理方面應(yīng)用較為廣泛。其中，免疫親和柱主要利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，目標(biāo)物吸附在親和柱上，非目標(biāo)物順柱流出，最后通過洗脫得到純化后的目標(biāo)物。另外，可通過合適的保存方法使親和柱重復(fù)使用[3]。由于免疫親和柱抗原抗體特異性結(jié)合的原理，免疫親和柱較固相萃取柱而言提取物純度更高，純化效果是普通方法的1000～10000倍。

目前免疫親和柱凈化能大大提高檢測效率，隨著檢測儀器的穩(wěn)定性、靈敏度和特異性的不斷提高，儀器方法抗干擾能力的不斷增強，有些不需要凈化的前處理方法也逐漸出現(xiàn)。

免疫分析技術(shù)概述

免疫學(xué)快速檢測方法包括膠體金免疫層析法、熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法等，應(yīng)用最廣泛的是膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)兩大類[2]，前者適用于現(xiàn)場快速篩查，簡單快捷；后者適用于實驗室大批量檢測，實現(xiàn)高通量篩查。

膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法利用了抗原抗體特異性結(jié)合原理，在硝酸纖維素膜（反應(yīng)載體）上固定了檢測蛋白（抗體或抗原）與包含有干燥金標(biāo)的金標(biāo)墊（玻璃纖維）連接。待檢物質(zhì)中的抗原或者抗體可與金顆粒發(fā)生特異性結(jié)合。將待檢液體點樣在樣品墊時，通過毛細血管力在金標(biāo)墊擴散，金標(biāo)物質(zhì)可與待測樣品中的分析物質(zhì)結(jié)合，分析物-金標(biāo)復(fù)合物在膜上擴散，移向檢測蛋白，通過觀察顯色線（T線）和控制線（C線）判斷檢測結(jié)果和質(zhì)量情況[4]。膠體金免疫層析法操作簡單快速、方便操作、經(jīng)濟安全。目前，在乳品安全檢測方面，利用該方法進行定性檢測是實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測最常見的方法，已被廣泛應(yīng)用于乳品安全監(jiān)測。乳品中常見的真菌毒素如黃曲霉毒素、農(nóng)獸藥殘留、違法添加等都是該方法的主要應(yīng)用對象。近年來，膠體金免疫層析法正逐漸從定性篩查向精準(zhǔn)定量發(fā)展和過渡[5]。目前，在各個領(lǐng)域已有很多企業(yè)使用該方法進行定量檢測，更加清晰明確地了解風(fēng)險程度，便于進行評估和制定風(fēng)險監(jiān)測計劃。

熒光免疫層析法

熒光免疫層析法依據(jù)熒光強度的變化對待檢樣品中微量或痕量物質(zhì)進行定量檢測，豐富了目前快速檢測市場對樣本檢測準(zhǔn)確定量的要求。

某些物質(zhì)能夠在紫外光的激發(fā)下輻射出不同顏色、不同強度的可見光，這種光線會隨著激發(fā)光的消失，在其不到1秒后消失，輻射的光叫做熒光，熒光通過電子從高能態(tài)躍遷至基態(tài)，能量以光的形式被釋放出來。將這些物質(zhì)作為熒光標(biāo)記物應(yīng)用到熒光免疫吸附法中[6]。按照檢測原理和形式差異，利用親和素-生物素與功能性基團，使熒光標(biāo)記物偶聯(lián)抗原、抗體等分子，形成具有示蹤并可以顯示免疫進程的熒光探針。目前常用的熒光免疫層析法有熒光微球免疫層析、量子點免疫層析、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析、時間分辨熒光免疫層析[7]。

熒光免疫層析法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、受自然熒光本底干擾低、快速定量等優(yōu)點，是目前食品質(zhì)量安全快速檢測分析研究的熱點。但在實際應(yīng)用中，受到環(huán)境因素、人為操作因素等影響，該方法的準(zhǔn)確性受到了一定的限制，解決熒光免疫層析法在實際應(yīng)用中檢測的準(zhǔn)確性問題是該技術(shù)在食品安全檢測行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵點。

其中，熒光微球免疫層析法有效改良了較早發(fā)展起來的熒光素標(biāo)記法，大大提高了免疫層析試紙條檢測的靈敏度；量子點免疫層析法與傳統(tǒng)染料方法相比，發(fā)射的熒光很穩(wěn)定，不僅量子產(chǎn)率高，還可抗熒光漂白，該方法的檢測靈敏度優(yōu)于膠體金試紙條，具有可定量、多標(biāo)記及高通量檢測等特點，具有潛力;上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析法原料與熒光染料和量子點納米顆粒相比，顆粒毒性低，靈敏度高，受外界干擾小，光源的信號穩(wěn)定性能優(yōu)秀，基本不受樣品中熒光基質(zhì)干預(yù)，是理想的熒光標(biāo)記物之一，但目前該技術(shù)主要應(yīng)用于生物大分子檢測方面，在試紙條方面較少，由于其技術(shù)制約和成本問題，限制了其在食品檢測行業(yè)的發(fā)展；時間分辨熒光免疫層析法，穩(wěn)定性更好，靈敏度較膠體金法高2-3個數(shù)量級[7]，是今后定量、多標(biāo)記免疫分析的發(fā)展方向，在食品檢測行業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

利用抗原抗體的高度特異性以及免疫酶的高效催化效果相結(jié)合而實現(xiàn)的一種免疫分析法。它通過抗原（或抗體）的固相化及其酶標(biāo)記。在固相載體表面的抗原（或抗體）表現(xiàn)出免疫活性。在固相載體上，酶標(biāo)抗原和抗體的被結(jié)合量和受檢標(biāo)本當(dāng)中的抗體抗原量會形成一定的比例，而在加入酶底物之后完成顯色，通過對有色產(chǎn)物進行定性定量的方式來確定其中的待測物含量。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)有直接檢測法、間接檢測法、直接競爭法、間接競爭法、雙抗體夾心法、斑點免疫吸附法、組織印跡法等不同檢測方法。

在乳品安全檢測方面，ELISA得到了廣泛運用，該方法在高通量檢測的同時，可提高檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[9]。

相比膠體金免疫層析法，ELISA具有抗干擾能力強、精準(zhǔn)度高、高通量等優(yōu)勢，主要應(yīng)用在實驗室檢測。在實際應(yīng)用中，企業(yè)通常采用膠體金免疫層析法進行現(xiàn)場篩查檢測，當(dāng)出現(xiàn)陽性檢測結(jié)果后，實驗室再以ELISA法進行復(fù)測。研究顯示，ELISA的檢測結(jié)果與高效液相色譜法相差較小[10]。因此，ELISA檢測試劑盒使用十分廣泛。

目前，ELISA技術(shù)研究卻仍處于發(fā)展階段，在實際應(yīng)用中依然存在反應(yīng)時間較長，難以同時分析多種成分、操作相對試紙條較復(fù)雜等問題。未來，可通過與色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等先進技術(shù)的結(jié)合，使其成為更有效的食品檢驗技術(shù)手段。

免疫層析法未來發(fā)展

免疫層析檢測法具有簡單快速、靈敏度高、特異性強、不需要儀器設(shè)備輔助等特點，在檢測時間、儀器設(shè)備、人員要求、費用、安全性等諸多方面較儀器法具有更突出的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域，是現(xiàn)場快速檢測的重要方法。隨著免疫層析檢測法的不斷發(fā)展，該檢測方法也從定性、半定量向定量檢測的方向不斷進步，尤其在定量檢測方面取得了巨大的進展。未來免疫層析法的發(fā)展方向依然是定量、靈敏、多元化、高通量檢測[8]。

在發(fā)展過程中，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)出來，新型標(biāo)記探針的開發(fā)、雙信號(比色和熒光)的輸出的檢測模式的建立, 都可提高檢測準(zhǔn)確度；同時，通過信號增強，以提高檢測靈敏度, 也是未來檢測發(fā)展的方向。隨著量子點和納米酶等新型高靈敏納米標(biāo)記物逐漸被開發(fā)優(yōu)化，結(jié)合生物化學(xué)、材料科學(xué)、光電技術(shù)和微流控技術(shù)，為快速檢測提供了更多的未來發(fā)展方向與多樣性。

展望

乳品安全已成為現(xiàn)代社會關(guān)注的一項重點問題，質(zhì)量檢測和監(jiān)督已深入人心。先進快速的檢測技術(shù)對乳品安全的發(fā)展尤為重要。綜上所述，目前國家標(biāo)準(zhǔn)中要求儀器法，可進行精確定量分析，靈敏度高，作為一種實驗室檢測技術(shù)有較大優(yōu)勢，但儀器分析法通常需要較為復(fù)雜的前處理方式，耗時、耗力，需要專業(yè)技術(shù)人員，檢測成本高，不利于在基層和生產(chǎn)企業(yè)中推廣應(yīng)用。因此，急需開發(fā)價格低廉、簡便快捷的快速檢測方法，以滿足不同環(huán)節(jié)對乳品安全的檢測需求。由于乳品種類豐富，體系復(fù)雜，檢測項目眾多，如何提高檢測樣本的豐富性，降低組分干擾，增加檢測通量，提高準(zhǔn)確度，并將其應(yīng)用要實際生產(chǎn)中，是未來乳品安全檢測發(fā)展的重要方向。 ■