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    E-cadherin參與IL-24抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移的實驗研究

    2020-02-20 04:38:36宋秀婧楊鐵波王明暉劉仁龍顧少巖
    中國免疫學(xué)雜志 2020年1期
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染小室孵育

    宋秀婧 楊鐵波 王明暉 劉仁龍 顧少巖 張 堯

    (齊齊哈爾市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)一科,齊齊哈爾 161000)

    肺癌屬于呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)生機制十分復(fù)雜,不僅與環(huán)境等外界因素有關(guān),還與細(xì)胞內(nèi)基因的表達調(diào)控有關(guān)[1]。IL-24是IL-10細(xì)胞因子家族成員之一,人體黑素細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等都可以表達IL-24[2]。最近的研究報告顯示,IL-24參與腫瘤的進展,過量的IL-24可以抑制腫瘤的生長,并且對于正常細(xì)胞生長沒有影響[3]。在肺癌中的研究報道顯示,IL-24轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞凋亡增多,細(xì)胞生長受到抑制,而對于正常的支氣管上皮細(xì)胞沒有影響,說明IL-24發(fā)揮誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡和抑制肺癌細(xì)胞生長的作用[4]。還有研究報道表明,IL-24還可以抑制卵巢癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移,并且可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達水平,IL-24抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用可能與E-cadherin有關(guān)[5,6]。目前對于IL-24對肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響和機制尚不明確。本實驗以明確IL-24對肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響和機制為目的,以肺癌細(xì)胞A549作為體外實驗對象,以期為闡明IL-24抗肺癌作用機制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1材料 肺癌細(xì)胞A549購自武漢普諾賽生命科技有限公司;pcDNA3.1-IL-24、pcDNA3.1購自北京合生基因科技有限公司;IL-24抗體、MMP-9抗體購自美國Abcam;cDNA合成試劑盒購自美國BIOMIGA;E-cadherin shRNA和shRNA陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;MMP-2、E-cadherin、Ki-67抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen。

    1.2方法

    1.2.1pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染和過表達效果檢測 肺癌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.1和IL-24過表達載體pcDNA3.1-IL-24,記為pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24,設(shè)置不轉(zhuǎn)染載體的肺癌細(xì)胞為對照組。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000,步驟同轉(zhuǎn)染試劑說明。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后2 d,用Real time PCR和Western blot方法測定過表達效果。

    1.2.1.1Real time PCR 每組取106個細(xì)胞,分別添加800 μl的TRIZOL試劑提取RNA,最后添加DEPC水將RNA溶解,以紫外分光光度計測定A260nm和A280nm比值在1.8~2.0之間。常規(guī)方法合成cDNA,步驟同cDNA合成試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄條件為:42℃孵育30 min,85℃孵育10 min。取cDNA,進行PCR反應(yīng),PCR包括:0.08 μl的上下游引物(20 μmol/L)、2 μl的cDNA模板、0.4 μl的TaqDNA聚合酶、10 μl的2×定量PCR Master Mix,最后添加ddH2O,共20 μl,PCR反應(yīng)條件為:95℃孵育3 min ;95℃孵育12 s,62℃孵育40 s,40個循環(huán)。以2-ΔΔCt方法計算IL-24表達水平。β-actin引物:F-5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′,R-5′-TCATAC-TCCTGCTTGCTGAT-3′。IL-24引物:F-5′-AATAGG-GCTAGCGCCACCATGAATTTTCAACAGAGGCT-3′,R-5′-GAATTCGGTCTCCTCGAGGAGCTTGTAGAATTTCT-GCA-3′。

    1.2.1.2Western blot 在細(xì)胞中添加裂解溶液,置于冰上孵育40 min,轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃,12 000 g離心10 min,吸取蛋白溶液(上清),常規(guī)BCA方法測定各組蛋白濃度,再添加Loading Buffer煮沸5 min。SDS-PAGE凝膠電泳時每個孔內(nèi)的蛋白樣品量為30 μg,50 V電壓條件下觀察藍色條帶已經(jīng)進入到分離膠及濃縮膠的分界處時,將電壓調(diào)整到120 V,觀察藍色條帶已經(jīng)跑出分離膠時,停止電泳。設(shè)置300 mA電流轉(zhuǎn)膜,把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜時間共100 min。取出PVDF膜,置于含5%牛血清白蛋白封閉液的平皿內(nèi)反應(yīng)2 h后,把PVDF膜再放置于抗體孵育袋中,添加IL-24一抗孵育液,封口后,置于4℃環(huán)境中過夜,按照同樣的方法與二抗在室溫中孵育2 h后,ECL發(fā)光,以Vision Workers LS分析條帶的光密度值,內(nèi)參設(shè)置為β-actin。

    1.2.2MTT測定IL-24對肺癌細(xì)胞增殖影響 按照Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24分組方法將肺癌細(xì)胞接種到96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)板取出后,分別用移液槍在每個孔內(nèi)添加10 μl的MTT,置于37℃中培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)板取出后,將孔內(nèi)的液體吸棄,每孔加150 μl的DMSO,反應(yīng)10 min后,置于酶標(biāo)儀上測定490 nm的A值。

    1.2.3Transwell小室測定IL-24對肺癌細(xì)胞侵襲和遷移影響 用含有1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液把Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24細(xì)胞均配制成每毫升含有105個的單細(xì)胞懸浮液,每組吸取200 μl 添加到Transwell小室的上室,同時吸取600 μl 含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液至下室內(nèi),培養(yǎng)2 d 以后,將小室取出,取棉簽將聚碳酸酯膜表面的細(xì)胞清除掉,添加PBS將膜洗滌2次,晾干,添加甲醛固定,結(jié)晶紫染色,在400倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)目。細(xì)胞侵襲實驗同上,侵襲實驗前用1∶6稀釋的基質(zhì)膠把Transwell小室濕化。

    1.2.4Western blot檢測IL-24對肺癌細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達影響 取Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24細(xì)胞培養(yǎng)2 d 以后,按照Western blot方法檢測細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達變化,步驟同1.2.1.2。

    1.2.5E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24共轉(zhuǎn)染對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移影響 在肺癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24,同時共轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照和pcDNA3.1-IL-24,分別設(shè)置為pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin和pcDNA 3.1-IL-24+shRNA-NC。按照上述MTT、Transwell小室和Western blot檢測細(xì)胞增殖、侵襲遷移和E-cadherin、MMP-2、MMP-9、Ki-67蛋白表達變化。

    2 結(jié)果

    2.1pcDNA3.1-IL-24提高肺癌細(xì)胞中IL-24表達水平 在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24,細(xì)胞中IL-24 mRNA和蛋白水平均升高。pcDNA3.1-IL-24提高肺癌細(xì)胞中IL-24的表達。見圖1和表1。

    2.2過表達IL-24抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移 在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24,細(xì)胞A490、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目及侵襲遷移蛋白MMP-9、MMP-2、增殖蛋白Ki-67表達水平均降低。過表達IL-24抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。見圖2和表2。

    2.3過表達IL-24上調(diào)肺癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達 在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24,細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達水平升高。過表達IL-24上調(diào)肺癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達水平。見圖3和表3。

    2.4E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細(xì)胞增殖侵襲和遷移作用 在肺癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA,細(xì)胞侵襲遷移數(shù)目和A490均高于共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和shRNA陰性對照的肺癌細(xì)胞。見表4。E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細(xì)胞增殖侵襲和遷移作用。

    圖1 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞中IL-24蛋白表達水平Fig.1 Western blot detection of IL-24 protein expression level in lung cancer cells transfectad with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control;2.pcDNA3.1;3.pcDNA3.1-IL-24.

    GroupsIL-24mRNAIL-24proteinControl1.00±0.090.23±0.04pcDNA3.11.01±0.130.22±0.06pcDNA3.1-IL-242.35±0.241)0.43±0.05F65.70616.403P0.0000.004

    Note:Compared with pcDNA3.1,1)P<0.05.

    2.5E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達作用 在肺癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA,細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白水平升高,E-cadherin蛋白水平降低,與共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和shRNA陰性對照的肺癌細(xì)胞比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4和表5。E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達作用。

    圖2 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白表達水平Fig.2 Western blot detection of MMP-9,MMP-2 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells transfected with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control;2.pcDNA3.1;3.pcDNA3.1-IL-24.

    GroupsE-cadherinControl0.13±0.02pcDNA3.10.14±0.04pcDNA3.1-IL-240.25±0.031)F13.759P0.006

    Note:Compared pcDNA3.1,1)P<0.05.

    GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationMMP-9MMP-2Ki-67Control0.45±0.0568.54±8.35135.64±12.080.67±0.080.64±0.060.53±0.05pcDNA3.10.44±0.0367.12±7.69133.80±10.650.70±0.060.65±0.040.54±0.03pcDNA3.1-IL-240.26±0.031)31.46±3.271)73.41±6.971)0.28±0.041)0.19±0.021)0.22±0.031)F23.93028.46936.64642.595110.94669.279P0.0010.0010.0000.0000.0000.000

    Note:Compared with pcDNA3.1,1)P<0.05.

    GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationpcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.27±0.0234.81±5.1670.98±8.12pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.38±0.031)54.16±4.781)98.63±7.551)t5.2844.7654.319P0.0060.0090.013

    Note:Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC,1)P<0.05.

    GroupsE-cadherinMMP-9MMP-2Ki-67pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.29±0.050.24±0.060.21±0.030.21±0.05pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.16±0.021)0.56±0.051)0.35±0.041)0.34±0.051)t4.1817.0974.8503.184P0.0140.0020.0080.033

    Note:Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC,1)P<0.05.

    圖3 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達水平Fig.3 Western blot detection of E-cadherin protein expression in lung cancer cells after transfection with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control;2.pcDNA3.1;3.pcDNA3.1-IL-24.

    圖4 Western blot檢測 pcDNA3.1-IL-24和E-cadherin shRNA共轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達水平Fig.4 Western blot detection of E-cadherin,MMP-2,MMP-9 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells co-transfected with pcDNA3.1-IL-24 and E-cadherin shRNANote: 1.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC;2.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin.

    3 討論

    IL-24是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因,其是在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的,后續(xù)人們根據(jù)其染色體定位、細(xì)胞因子樣特性等方面綜合考慮將其歸于IL-10家族,其可以高效且具有選擇性地發(fā)揮抗腫瘤作用,具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功效[7-9]。很多研究報道顯示,在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IL-24可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞生長侵襲和遷移,IL-24是一個具有潛力的腫瘤抑制因子[10]。目前在宮頸癌細(xì)胞中的研究報道表明,IL-24可以在體外抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移,在黑色素瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)IL-24具有抗腫瘤侵襲的作用[11,12]。在肺癌細(xì)胞中已經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-24可以抑制肺癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生,說明IL-24在肺癌中可能也發(fā)揮抑制作用[13]。本次實驗在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IL-24,發(fā)現(xiàn)過表達IL-24后的肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均降低,這提示,IL-24具有抗肺癌細(xì)胞增殖侵襲和遷移的作用,說明IL-24是一個肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移抑制因子,對于其在其他各株肺癌細(xì)胞和肺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚,還需要在以后的實驗中進行驗證。

    腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移等均受到細(xì)胞內(nèi)多種基因的調(diào)控作用,目前已知Ki-67是細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志蛋白,其表達水平越高表明細(xì)胞增殖能力越強,反之其表達水平降低后標(biāo)志著細(xì)胞增殖能力下降[14]。腫瘤細(xì)胞從原來的位置脫落經(jīng)過血管或淋巴管進入到遠端組織惡性增殖形成轉(zhuǎn)移灶的過程需要細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的作用,腫瘤細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)降解酶是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的基礎(chǔ)[15,16]。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族,而基質(zhì)金屬蛋白酶是細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要原因,MMP-2和MMP-9也是目前發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的蛋白酶[17,18]。本次實驗發(fā)現(xiàn)過表達IL-24后的肺癌細(xì)胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白水平均降低,說明IL-24具有抗肺癌細(xì)胞侵襲遷移和增殖的作用,這與檢測細(xì)胞增殖、侵襲和遷移結(jié)果一致。

    目前對于IL-24抗腫瘤機制研究尚不明確,在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),IL-24高表達后的肝癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達水平升高,后續(xù)在宮頸癌等腫瘤中也證實IL-24可以提高E-cadherin蛋白表達水平,IL-24作用機制可能與E-cadherin有關(guān)[19,20]。本實驗證實,過表達IL-24后的肺癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達水平升高,并且下調(diào)E-cadherin可以逆轉(zhuǎn)過表達IL-24對肺癌細(xì)胞增殖侵襲和遷移的作用,這提示IL-24通過上調(diào)E-cadherin的表達抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

    總而言之,IL-24具有體外抗肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用,其作用機制與上調(diào)E-cadherin有關(guān),這為研究IL-24的抗腫瘤機制提供了參考,在肺癌細(xì)胞中表達外源性的IL-24可能是治療肺癌的潛在途徑。

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