小檗堿干預(yù)脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S分泌NO、IL-6等炎性介質(zhì)的機(jī)制研究

孫 垚 朱 歡 張 躍 (南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，南京 210008)

肺泡巨噬細(xì)胞存在于肺泡內(nèi)，是肺部巨噬細(xì)胞的主要種類，在正常生理環(huán)境下，其主要作用是清除組織內(nèi)細(xì)胞碎片或無害抗原[1]。在肺組織受到致病微生物侵襲或者損傷時(shí)，肺泡巨噬細(xì)胞會啟動強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)以維持組織穩(wěn)態(tài)，但過度的炎性反應(yīng)往往會加重組織損傷，從而誘發(fā)各種肺部疾病[2]。目前針對肺部炎癥反應(yīng)的治療藥物主要分為抗生素和糖皮質(zhì)激素兩類，前者以清除致病菌為主，后者以消除炎癥為主[3-5]。然而，抗生素的過度使用極易出現(xiàn)耐藥性，激素類藥物又容易出現(xiàn)不良反應(yīng)[6,7]。因此，尋求新的抗炎藥物對于肺部炎癥疾病乃至其他類炎癥相關(guān)疾病的治療具有重大意義。

小檗堿(Berberine，BBR)主要存在于毛茛目毛茛科、小檗科、防己科及罌粟科植物中，此外在蕓香科植物中也有較多分布，是一種具有廣泛藥理活性的生物堿類成分[8]。研究表明，小檗堿有很強(qiáng)的抗炎抑菌作用，其能通過對NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ)信號等通路的調(diào)節(jié)，影響免疫細(xì)胞之間的平衡，抑制炎癥因子的分泌和表達(dá)、減輕組織損傷等多種作用途徑來減輕或抑制炎癥的產(chǎn)生與發(fā)展[9-12]。目前有關(guān)小檗堿體外抗炎作用機(jī)制的研究主要集中在單核細(xì)胞(THP-1)或腹腔巨噬細(xì)胞(RAW264.7)等，本文旨在研究小檗堿對LPS誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株MH-S購自美國ATCC；BBR購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，HPLC純度≥98%；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide]購自美國Sigma公司；TRIzon總RNA提取試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；iTaqTMUniversal SYBR Green supermix購自美國BIO-RAD公司；5×All in one RT-MasterMix購自上海斯信生物科技有限公司；一氧化氮(NO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-1及IL-12 ELISA試劑盒購自南京翼飛雪生物科技有限公司；一抗誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子(MyD88)、白介素1受體關(guān)聯(lián)激酶4(IRAK-4)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、β肌動蛋白(β-actin)及二抗HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MH-S細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測小檗堿對MH-S細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞，接種6 h后，加入終濃度為0、1、5、10 μmol/L的小檗堿。培養(yǎng)6、12、18、24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(0.5 mg/ml)100 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μl二甲基亞砜，充分溶解反應(yīng)產(chǎn)物后，于490 nm處測定各孔吸光度值，計(jì)算不同濃度小檗堿對細(xì)胞生長活力的影響。

1.2.3Western blot法檢測小檗堿對LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔約2×105個(gè)細(xì)胞，接種6 h后，除空白對照孔外，每孔加入終濃度為0.5 μg/ml的LPS溶液。設(shè)置模型孔(含LPS，不含小檗堿)，其他每孔分別加入1、2、5 μmol/L的小檗堿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用無菌管收集細(xì)胞上清液，進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測。細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，每孔加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液100～150 μl，裂解后將細(xì)胞小心刮下離心取上清，BCA法檢測細(xì)胞蛋白的濃度。調(diào)整蛋白濃度，取相同總量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用4%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST清洗后加入一抗于4℃孵育過夜，TBST清洗后加入二抗于室溫孵育2 h，TBST清洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。采用Image Pro-Plus 6.0軟件分析電泳條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4RT-PCR檢測小檗堿對LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞炎癥因子的影響 按照1.2.2中方法進(jìn)行MH-S細(xì)胞的接板、給藥。給藥48 h后，棄去上清液，用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌2次，加入TRIzon總RNA提取試劑提取RNA。RNA逆轉(zhuǎn)錄參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將試劑混勻，放入逆轉(zhuǎn)錄儀器中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄所得產(chǎn)物直接進(jìn)行熒光定量PCR，參照試劑盒說明書在專用低位PCR反應(yīng)孔板中加入相關(guān)反應(yīng)物，引物序列見表1，參照試劑盒說明書所列程序進(jìn)行反應(yīng)。以β-actin做內(nèi)參，所得結(jié)果將原始值進(jìn)行2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.5細(xì)胞上清液NO、炎癥因子的含量檢測 按照相關(guān)試劑盒所附說明書的操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算各細(xì)胞因子的含量。

2 結(jié)果

2.1小檗堿對MH-S細(xì)胞活力的影響 結(jié)果如圖1所示，小檗堿在1、5 μmol/L的濃度作用24 h，對MH-S細(xì)胞的生長活力幾乎沒有影響；在10 μmol/L的濃度下，能明顯降低MH-S細(xì)胞的活力，在作用超過12 h開始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈一定的時(shí)效性。因此，小檗堿的給藥濃度最大不能超過 5 μmol/L。

2.2小檗堿對LPS刺激MH-S細(xì)胞炎癥因子的影響 結(jié)果如圖2所示，0.5 μg/ml的LPS作用MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的含量明顯升高(P<0.01)。給予不同濃度的小檗堿刺激后，NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的水平有不同程度地下降，并呈一定的量效關(guān)系。

圖1 小檗堿作用不同時(shí)間對MH-S細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of berberine on viability of MH-S cells at different timesNote:Compared with the 0 μmol/L group,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3小檗堿對LPS刺激MH-S細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12 mRNA的影響 結(jié)果如圖3所示，0.5 μg/ml 的LPS作用MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12等炎癥因子mRNA的表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。給予不同濃度的小檗堿刺激后，NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的mRNA水平呈濃度依賴性地下調(diào)，并在劑量為5 μmol/L時(shí)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4小檗堿對LPS刺激MH-S細(xì)胞中iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65的影響 結(jié)果見表2和圖4，0.5 μg/ml的LPS作用MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。給予5 μmol/L的小檗堿刺激后，MH-S細(xì)胞iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。

表1 引物序列
Tab.1 Sequences of primers for real-time PCR

NameForward(5′→3′)Reverse(5′→3′)Product(bp)TNF-αCCTGTAGCCCACGTCGTAGGGGAGTAGACAAGGTACAACCC148IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAGAGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG131IL-1GAAATGCCACCTTTTGACAGTGTGGATGCTCTCATCAGGACAG116IL-12CTGTGCCTTGGTAGCATCTATGGCAGAGTCTCGCCATTATGATTC169β-actinGGCTGTATTCCCCTCCATCGCCAGTTGGTAACAATGCCATGT154

圖2 小檗堿對MH-S中NO(A)、TNF-α(B)、IL-6(C)、IL-1(D)及IL-12(E)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of berberine on expression of NO(A),TNF-α(B),IL-6(C),IL-1(D) and IL-12(E) in MH-S cellsNote:Compared with the Model group(LPS+,BBR-),*.P<0.05,**.P<0.01.

GroupsiNOSTLR4MyD88IRAK-4NF-κBp65Control0.28±0.132)0.66±0.112)0.49±0.082)0.35±0.052)0.84±0.072)Model2.01±0.162.47±0.422.73±0.171.89±0.102.19±0.24BBR1.27±0.162)1.56±0.181)1.30±0.102)0.84±0.072)1.28±0.171)

Note：Compared with the Model group,1)P<0.05,2)P<0.01.

圖3 小檗堿對MH-S中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12 mRNA的影響Fig.3 Effect of berberine on mRNA level of TNF-α,IL-6,IL-1 and IL-12 in MH-S cellsNote:Compared with the Model group(LPS+，BBR-),*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 小檗堿對LPS刺激MH-S細(xì)胞中iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65蛋白的影響Fig.4 Effect of berberine on expression of iNOS,TLR4,MyD88,IRAK-4 and NF-κB p65 in MH-S cells induced by LPS

3 討論

巨噬細(xì)胞是吞噬細(xì)胞的一種，是機(jī)體抵抗外來病原體侵襲的重要組成部分，其主要功能是對細(xì)胞碎片及病原體進(jìn)行吞噬作用，激活免疫細(xì)胞并引起炎癥反應(yīng)。肺泡巨噬細(xì)胞長期存在于肺泡內(nèi)，是肺部巨噬細(xì)胞的主要種類，是宿主抵御外部侵襲的第一道防線，在維持肺部免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。在肺部受到外來或內(nèi)在致病因素刺激后，肺泡巨噬細(xì)胞被激活并釋放大量炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體、危險(xiǎn)信號分子等[14]。其中趨化因子能繼續(xù)招募單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，或作為刺激劑激活肺上皮細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞，從而建立肺部炎癥微環(huán)境[15]。在炎性環(huán)境下，巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體表達(dá)增加，刺激多種炎癥因子的激活、表達(dá)、釋放。研究表明，肺泡巨噬細(xì)胞的活化與多種肺部疾病相關(guān)，包括急性肺損傷、慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺纖維化等[16-20]。

巨噬細(xì)胞在受到LPS等刺激下，會活化并釋放大量炎癥分子或因子，包括NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12等[21]。NO由iNOS催化合成，在LPS的刺激下，巨噬細(xì)胞大量合成并釋放NO，在殺傷病原體的同時(shí)對周圍正常細(xì)胞也造成損害[22]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌的一種小分子蛋白，其作用于細(xì)胞表面時(shí)，與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后能形成復(fù)體，從而激活下游的一系列蛋白激酶，進(jìn)而激活NF-κB和JNK信號通路，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等病理過程[23]。IL-6、IL-1及IL-12均屬白介素家族，主要由巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞等產(chǎn)生。在正常生理?xiàng)l件下含量極低，在病理狀態(tài)下如COPD、肺損傷，該類白介素含量急劇升高。IL-6能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增生和分化，參與免疫調(diào)節(jié)，引起免疫性病理損傷[24]。IL-1是參與炎癥反應(yīng)的最重要的細(xì)胞因子之一，能誘導(dǎo)出與TNF-α相似的生理和代謝改變，并能與TNF-α產(chǎn)生相互協(xié)同作用[25]。IL-12作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有多種生理功能，其一方面能促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮合酶，釋放活性氮，增強(qiáng)吞噬功能和局部炎癥反應(yīng)；另一方面能促進(jìn)Th1型細(xì)胞分化，抑制Th2型細(xì)胞分化，促進(jìn)IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[26]。

小檗堿是一種季銨類型的生物堿，常用于治療各種炎癥疾病及細(xì)菌感染。藥理研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能改善細(xì)胞內(nèi)脂滴的聚集和氧化應(yīng)激，從而改善棕櫚酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[27]；并能通過抑制抗原誘導(dǎo)的Lyn、Syk和Gab2的磷酸化，從而抑制下游MAPK通路，在過敏反應(yīng)的體內(nèi)模型中，小檗堿的使用通過上述途徑抑制小鼠的被動皮膚過敏反應(yīng)[28]。但有關(guān)小檗堿對肺泡巨噬細(xì)胞活化影響的相關(guān)研究較少，本文研究結(jié)果表明，小檗堿能夠明顯抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞活化，降低NO的分泌量，同時(shí)劑量依賴性地在蛋白層面及基因?qū)用嫦抡{(diào)TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12等炎癥因子的含量，具有顯著的抗炎作用。

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是一類天然免疫受體，在自然界動物體內(nèi)廣泛分布，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。TLRs能夠直接識別并結(jié)合病原體或其產(chǎn)物，引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放[29]。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)TLRs蛋白，其與相應(yīng)配體結(jié)合后，能進(jìn)一步激活NF-κB，從而促進(jìn)各種炎性因子基因表達(dá)的激活。由LPS激活的TLR4/NF-κB信號通路主要分為MyD88依賴的信號通路及MyD88非依賴的信號通路。在細(xì)胞表面，TLR4與LPS結(jié)合后發(fā)生聚合將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，與MyD88的羧基端結(jié)合，同時(shí)MyD88的氨基端與IRAK-4結(jié)合，并激活TRAF-6，進(jìn)而激活I(lǐng)KKs復(fù)合物，NF-κB抑制物在IKKs復(fù)合物的作用下發(fā)生磷酸化并降解，使得NF-κB激活并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-1、IL-6及IL-12等的表達(dá)[30-32]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠通過抑制iNOS的活性，減少NO的釋放，另一方面通過抑制TLR4/MyD88/IRAK-4通路的活化，進(jìn)而抑制NF-κB的激活，從而減少炎癥介質(zhì)的釋放。