慢病毒介導NFAT基因對HepG2細胞生物學行為的影響①

許 洋 張雅敏 王 建 楊 龍 劉子榮 (天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 300192)

活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)最初作為與人T細胞中IL-2啟動子的抗原受體應答元件-2(ARRE-2)相結合的誘導型核因子被發(fā)現(xiàn)[1]。NFAT家族包括5名成員：NFATc1(也稱NFAT2)、NFATc2(NFAT1)、NFATc3(NFAT4)、NFATc4(NFAT3)和NFAT5，當細胞受到信號刺激時，通過鈣離子/鈣調(diào)蛋白激酶信號通路，使 NFAT 蛋白迅速去磷酸化，進入細胞核內(nèi)，與 NFAT 靶基因上的位點結合發(fā)揮其介導的基因轉錄調(diào)節(jié)功能。NFAT信號傳導的失調(diào)與腫瘤惡性表型和腫瘤進展有關，其已顯示出在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，細胞的增殖、分化、侵襲、轉移、血管形成和腫瘤微環(huán)境中起到的重要作用[2]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)作為血管生成刺激因子，在血管生成的調(diào)節(jié)中起重要作用，是血管系統(tǒng)發(fā)育和分化所必需的，當它與血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)結合后，會使眾多通道上游和下游信號形成級聯(lián)，最終增強內(nèi)皮細胞周圍組織的增殖、遷移、通透和滲透能力。然而NFAT在肝癌中的作用并沒有明確，并且在肝癌中NFAT與VEGFA的關系不清楚，為進一步探索NFAT蛋白與肝癌發(fā)生發(fā)展及其惡性特征的關系，本實驗將利用shRNA干擾技術，觀察干擾NFAT基因對于人肝癌HepG2細胞生長增殖、細胞侵襲遷徙及對VEGFA分子表達的影響，進一步揭示 NFAT 相關通路與臨床肝癌發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝細胞癌細胞系HepG2購自北京協(xié)和細胞中心，DMEM高糖液體培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，兔抗人NFAT多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購自英國Abcam公司，羊抗兔IgG—HRP第二抗體購自武漢博士德公司，總RNA提取試劑Trizol、逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自大連TaKaRa公司(Cell counting kit-8)CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1shRNA載體慢病毒的合成 根據(jù)GenBank的人NFAT mRNA(NM_172390)編碼區(qū)序列，遵循設計原則，設計干擾病毒，并設置陰性對照，shRNA慢病毒表達載體構建工作由上海吉凱公司完成。序列如下：NFAT-shRNA101：5′-CcggcgGAATCCTGAAACTCAGAAACTCGAGTTTCTGAGTTTCAGGATT-CCGTTTTTg-3′，NFAT-shRNA102：5′-CcggAAGCCGAATTCTCTGGTGGTTCTCGAGAACCACCAGAGA-ATTCGGCTTTTTTTg-3′，NFAT-shRNA103：5′-CcggCTGCATGGCTACTTGGAGAATCTCGAGATTCTCCA-AGTAGCCATGCAGTTTTTg-3′，陰性對照(CON313)：5′-CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAACGTGA-CACGTTCGGAGAATTTTTg-3′，陰性對照分子序列與NFAT基因及靶細胞內(nèi)其他基因無明顯同源性。

1.2.2細胞培養(yǎng)與轉染 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/L，37℃、5%CO2，孵箱內(nèi)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞用0.25%的胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，接種至6孔板中，貼壁后遵循慢病毒轉染說明書，以MOI=10指數(shù)轉染六孔板中細胞，加人終濃度5 μg/ml的Polybrene，8～12 h根據(jù)細胞狀態(tài)更換新鮮完全培養(yǎng)基，72 h后應用熒光觀察及嘌呤霉素進行穩(wěn)定株篩選，嘌呤霉素篩選13 d后藥物克隆(細胞群落)出現(xiàn)，用浸有0.25%胰酶的無菌棉簽將群落消化，轉移至25 cm培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，得到穩(wěn)定轉染細胞克隆。細胞分組：未處理的HepG2細胞為對照組，陰性對照慢病毒轉染的HepG2細胞為陰性對照組，3種干擾慢病毒轉染的HepG2細胞為干擾組。

1.2.3Real-time PCR檢測NFAT mRNA、VEGFA mRNA表達 收集各組細胞用磷酸鹽緩沖液洗滌后用Trizol一步抽提法提取細胞總RNA，按照逆轉錄盒及實時定量PCR試劑盒說明進行逆轉錄及Real-time PCR反應，引物用設計軟件Primer premier5.0 設計，由蘇州金唯智公司合成。NFAT上游引物：5′-CTCACAGCGATCTATTGTTCC-3′，下游引物：5′-CCTTCAGGTTGTTTCTTTCC-3′，PCR產(chǎn)物265 bp；VEGFA上游引物：5′-GAAAGACAGATCACAGGTACAG-3′，下游引物：5′-TTCCAACAATGTGTCTCTTC-3′，PCR產(chǎn)物241 bp；β-actin上游引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′，PCR產(chǎn)物500 bp。PCR擴增條件：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)，通過2-ΔΔCt計算各組相對對照組表達量。

1.2.4Western blot檢測NFAT蛋白、VEGFA蛋白水平的表達 提取各組細胞蛋白并進行蛋白定量，將蛋白樣品和5× loading buffer按4∶1的比例混勻，置于沸水中加熱10 min，配制10%SDS-PAGE分離膠，配制濃縮膠，后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶室溫封閉2 h，加入NFAT一抗(1∶1 000)、VEGFA一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶5 000)4℃過夜，后以TBST洗脫，1∶3 000二抗封閉作用2 h，TBST洗脫，ECL顯影觀察結果。

1.2.5CCK-8檢測細胞增殖能力 調(diào)整各組細胞濃度為5×104ml-1，接種陰性對照組細胞(NC組)、對照組細胞(control)及干擾組細胞(shRNA)于96孔板中，每孔各100 μl，每組設置5個平行對照并設置不含細胞的空白對照，培養(yǎng)5 d，每天相同時間點進行檢測，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測450 nm波長下OD值。

1.2.6Transwell 實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力 細胞饑餓24 h后，調(diào)整各組細胞濃度為5×104ml-1，以無血清DMEM培養(yǎng)基配制單細胞懸液，每個Transwell上室加入200 μl細胞懸液，下室加入650 μl含10%FBS血清的DMEM培養(yǎng)基，侵襲實驗于小室上層鋪Matrigel基質(zhì)膠，遷徙實驗則不鋪膠。培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦干小室上層，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，沖洗干凈，在200倍視野下隨機選取5個視野拍照計數(shù)。

2 結果

2.1細胞轉染效率 陰性對照組及NFAT-shRNA(101-103)慢病毒轉染的HepG2細胞內(nèi)可見綠色熒光。各組慢病毒轉染后轉染效率達80%以上，后以嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉染單克隆細胞系，見圖1。

2.2Real-Time PCR檢測穩(wěn)定細胞株中NFAT mRNA、VEGFA mRNA表達 結果顯示，陰性對照組與對照組之間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102、NFAT-shRNA103干擾組中NFAT mRNA表達較對照組及陰性對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明轉染攜帶表達載體的慢病毒后能有效沉默人肝癌HepG2細胞中NFAT的表達，其中shRNA103干擾效果最明顯，干擾效率最高，見圖2、3。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組HepG2細胞轉染效果Fig.1 Fluorescence microscopy was used to detected HepG2 cells transfected with each groupNote:A.NFAT-shRNA101；B.NFAT-shRNA102;C.NFAT-shRNA103；D.NFAT-NC.

圖2 HepG2各組細胞轉染后NFAT mRNA表達量Fig.2 HepG2 expression of NFAT mRNA after transfectedNote:NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

2.3Western blot檢測各組穩(wěn)定細胞株中NFAT及VEGFA蛋白表達 結果顯示，陰性對照組與對照組蛋白水平表達無明顯差異，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102、NFAT-shRNA103 干擾組中NFAT蛋白表達水平較對照組及陰性對照組降低，其中shRNA103組蛋白幾乎不表達，表明其干擾效果最明顯，干擾效率最高。結果顯示，NFAT干擾組中VEGFA蛋白水平表達較對照組及陰性對照組降低，見圖4、5。

圖3 HepG2各組細胞轉染后VEGFA mRNA表達量Fig.3 HepG2 expression of VEGFA mRNA after transfectedNote:NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖4 Western blot檢測人肝癌HepG2細胞 NFAT蛋白表達Fig.4 Western blot analysis were used to detect NFAT expression in HepG2 cell linesNote:A.Control;B.Negative control;C.NFAT-shRNA101;D.NFAT-shRNA102;E.NFAT-shRNA103.*.P<0.05,vs NFAT-NC and Control;**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

2.4干擾NFAT基因后對HepG2細胞增殖能力的影響 陰性對照組與對照組對于細胞增殖的影響差異未見明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，NFAT-shRNA組細胞增殖能力受到明顯抑制，與陰性對照組及對照組相比有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明干擾NFAT基因后，能有效抑制HepG2細胞的增殖，見圖6。

圖5 Western blot檢測人肝癌HepG2細胞VEGFA蛋白表達Fig.5 Western blot analysis were used to detect VEGFA expression in human HepG2 cell linesNote:A.Control;B.Negative control;C.NFAT-shRNA103.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖6 CCK-8檢測細胞增殖能力Fig.6 Determination of cell proliferation by CCK-8Note:*.P<0.05,vs NFAT-NC and Control.

圖7 Transwell檢測HepG2細胞侵襲能力Fig.7 Transwell assays of HepG2 cells invasion ability

2.5干擾NFAT基因對HepG2細胞遷徙及侵襲能力的影響 HepG2細胞遷徙實驗結果顯示，相對于對照組及陰性對照組，干擾組遷徙及侵襲數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明干擾NFAT基因后，能有效抑制HepG2細胞的遷徙及侵襲能力，見圖7～10。

圖8 各組HepG2細胞穿膜數(shù)Fig.8 Number of invasion of HepG2 cells in each groupNote:NFAT-NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖9 Transwell檢測細胞遷徙能力Fig.9 Transwell assays of HepG2 cells migration ability

圖10 各組HepG2細胞穿膜數(shù)Fig.10 Number of migration of HepG2 cells in each groupNote:NFAT-NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

3 討論

原發(fā)性肝癌作為全世界最常見的惡性腫瘤，其在惡性腫瘤的死因中位列第二位，僅2015年全球新發(fā)病人數(shù)約745 000人[3]。盡管目前的手術治療及相關藥物治療效果較過去有明顯提高，術后5年生存率可達50%～60%，但復發(fā)率也高達60%～70%，對于早期診斷、手術后高復發(fā)率、高轉移率及不良預后的問題仍亟待解決。因此，為了改善及提升原發(fā)性肝癌治療的預后，關鍵在于對肝癌發(fā)生機制中相關新型特異性及敏感性靶點的發(fā)現(xiàn)及研究。本課題組在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，能抑制NFAT的轉錄活化，而且其能顯著抑制HepG2和HepG2.2.15細胞增殖，其抑制增殖作用隨劑量增加而增強，這提示 NFAT 可能為促癌基因，NFAT信號通路的激活與肝癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，抑制NFAT信號通路可能會阻止肝癌的進展[4]。同時NFAT具有多向調(diào)節(jié)功能，其不僅在多種免疫細胞如T細胞、B細胞、NK細胞中有表達，在非免疫細胞中也存在普遍表達，并且在胚胎發(fā)育、器官生成中起到重要作用[5,6]。一些研究證實，在人類實體惡性腫瘤及血液惡性腫瘤中，NFAT均存在過表達現(xiàn)象，并且在惡性腫瘤的生長增殖、細胞侵襲遷徙、血管生成及轉移的調(diào)節(jié)中扮演重要角色[7,8]。

基因沉默技術常用到的為小干擾RNA(siRNA)，其為一個長20～25個核苷酸的雙股RNA，在生物學上有許多不同的用途，目前siRNA主要參與RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)目的基因的表達，對特定基因產(chǎn)生具有專一性的敲弱效果，基因沉默技術的發(fā)展為腫瘤基因靶向治療提供了新的途徑[9,10]。傳統(tǒng)的干擾基因方式為通過轉染siRNA的方法使之進入細胞內(nèi)，參與到RNAi途徑，發(fā)揮使靶基因沉默的效應，這一方法受轉染效率的影響較大。本實驗采用含shRNA表達載體的慢病毒干擾目的基因，相對于siRNA瞬轉方式，其轉染細胞時，載體可以穩(wěn)定地整合到基因組中，在細胞內(nèi)轉錄生成shRNA,利用細胞內(nèi)的Dicer酶，生成相應的siRNA，發(fā)揮RNAi作用，并且在細胞中脫靶效應要低于siRNA，其感染細胞效率高，干擾效果持久且穩(wěn)定，后期經(jīng)嘌呤霉素篩選出單克隆細胞株，形成穩(wěn)定轉染細胞系。

為保證mRNA被有效抑制，本實驗針對不同靶點設計3種不同shRNA，在3種干擾病毒作用下，PCR及Western blot結果顯示，相對于對照組，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102及NFAT-shRNA 103組中NFAT mRNA及NFAT蛋白均明顯降低，HepG2細胞中NFAT基因受到抑制，根據(jù)結果，確定NFAT-shRNA103組為干擾效果最好，故后續(xù)實驗以其作為干擾組。同時，陰性對照組未見明顯抑制，表明shRNA抑制具有特異性。各組VEGFA的基因表達及蛋白表達結果表明，NFAT對于VEGFA的表達有促進作用，其很可能作為NFAT下游的靶蛋白而發(fā)揮作用。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT通路后，腫瘤細胞的侵襲及增殖能力大大增強。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)當使用siRNA沉默細胞內(nèi)VEGFA基因表達時，其Transwell結果顯示侵襲實驗及遷徙實驗中細胞穿膜數(shù)均較對照組明顯減少，且細胞增殖能力明顯減弱。本實驗中CCK-8及Transwell實驗證明干擾NFAT基因，VEGFA基因及蛋白表達量明顯減弱，細胞增殖活性、侵襲及遷徙能力顯著降低，這些結果表明NFAT可能為其生物學行為改變的重要基因，激活的NFAT蛋白可能激活下游VEGFA基因，促進VEGFA蛋白轉錄活化，增強了腫瘤細胞侵襲及增殖能力，而干擾NFAT的表達后，其生物學惡性行為明顯減弱。Müller等[13]發(fā)現(xiàn)VEGF由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞及腫瘤細胞分泌，其與內(nèi)皮細胞上相關受體(VEGFAR)結合后，引起PLCγ的激活，從而引起鈣內(nèi)流而使NFAT蛋白轉錄活化，而激活的NFAT蛋白又促進了VEGFA及VEGFAR的合成從而形成瀑布式效應。所以激活NFAT通路后VEGFA及其受體會持續(xù)轉錄活化，促進細胞生長增殖、侵襲及遷徙能力。

綜上所述，NFAT蛋白在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，活化的NFAT蛋白可能通過級聯(lián)作用激活下游的VEGFA因子，從而增強細胞的生物學功能。通過使用靶向NFAT的shRNA載體轉染后，不僅抑制NFAT在細胞內(nèi)的水平，還特異性抑制其生物學行為，提示NFAT可作為肝癌基因治療的潛在靶點，為臨床肝癌的診斷及治療提供新思路。此外，抑制過表達NFAT基因導致細胞增殖、侵襲及遷徙能力改變是否完全依賴于VEGFA的作用，是否存在其他下游靶點的激活或抑制，其作用機制還有待進一步研究。