后抗生素時(shí)代的輔助抗菌策略研究進(jìn)展

劉暢，沈瀚

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008

抗生素是人類醫(yī)學(xué)史上最偉大的成就之一，其廣泛應(yīng)用曾一度使人類暫時(shí)擺脫了感染性疾病的威脅，開創(chuàng)了人類抗感染治療的新紀(jì)元。然而，抗生素的大量使用導(dǎo)致多重耐藥細(xì)菌比例正呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢(shì)，新型細(xì)菌耐藥機(jī)制正不斷涌現(xiàn)，嚴(yán)重危害了患者的生命健康安全。更為嚴(yán)峻的是，傳統(tǒng)抗生素研究自上世紀(jì)60年代以來已進(jìn)入瓶頸期，新型抗菌藥物的研發(fā)進(jìn)度已經(jīng)逐漸落后，人類正被迫走向“后抗生素時(shí)代”。在這一背景下，能夠與傳統(tǒng)抗生素相結(jié)合、通過多種方式提高抗感染治療效率的輔助抗菌策略成為最近幾年的研究熱點(diǎn)。

1 增強(qiáng)細(xì)菌外膜的藥物通透性

細(xì)菌外膜位于革蘭陰性菌肽聚糖層外側(cè)，對(duì)于通過物質(zhì)的分子大小、電荷、空間位阻具有選擇性，是細(xì)菌抵抗抗菌藥物的第一道防線。不僅如此，研究還表明細(xì)菌外膜的物理強(qiáng)度也遠(yuǎn)超于傳統(tǒng)認(rèn)知，在細(xì)菌肽聚糖層受損時(shí)能夠承擔(dān)一部分結(jié)構(gòu)支撐作用[1]。細(xì)菌在外膜受損時(shí)生存能力較差，Tran等發(fā)現(xiàn)在使用多粘菌素破壞細(xì)菌外膜后，抗腫瘤藥物米托坦（mitotane）獲得了十分顯著的抗菌能力，即使對(duì)于多粘菌素耐藥菌株也具有較好的療效。該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因目前仍有待探討，研究認(rèn)為可能與米托坦在細(xì)菌外膜受損后大量進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部有關(guān)[2]。盡管目前米托坦的抗菌機(jī)制尚不清楚，但由于多粘菌素-米托坦這一用藥組合明顯區(qū)別于臨床常用抗菌藥物，細(xì)菌尚未獲得相應(yīng)的耐藥能力，因此在使用這一方案應(yīng)對(duì)臨床多重耐藥細(xì)菌時(shí)能夠取得較為理想的治療效果[2]。以多粘菌素為代表的陽離子抗菌多肽對(duì)于細(xì)菌外膜具有破壞作用，是傳統(tǒng)抗菌藥物的理想“擴(kuò)增器”。多粘菌素衍生物SPR741不僅在體外實(shí)驗(yàn)中能夠有效降低多重耐藥大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的治療難度，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也能夠顯著提高受感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存率，目前已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其臨床應(yīng)用價(jià)值未來可期。

2 抑制細(xì)菌外排泵活性

外排泵是能夠?qū)⒓?xì)菌胞內(nèi)藥物或毒性物質(zhì)排出胞外的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，是細(xì)菌在抗生素壓力下維持生存的重要機(jī)制之一。目前已知的細(xì)菌外排泵系統(tǒng)可根據(jù)氨基酸序列和底物類型分為5個(gè)超家族，它們分別是ATP結(jié)合盒超家族（ATP-inding cassette superfamily，ABC）、主要促進(jìn)劑超家族（major facilitator superfamily，MFS）、耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族（resistance nodulation division family，RND）、小多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)分子家族（small multidrug resistance family，SMR）和多藥及毒性化合物外排分子家族（multiantimicrobial and toxic compound extrusion，MATE），其中以 RND 家族在多重耐藥細(xì)菌中的分布最為廣泛。

使用外排泵抑制劑降低多重耐藥細(xì)菌耐藥性的相關(guān)研究已較為深入，羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP）屬于外排泵能量阻斷劑，可在穿過細(xì)菌磷脂雙層后解離并釋放質(zhì)子，通過破壞細(xì)菌的跨膜電化學(xué)梯度降低細(xì)菌外排泵活性[3]；苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺（phenylalanyl-arginyl-β-naphthylamide，PAβN）通過競(jìng)爭(zhēng)抑制細(xì)菌外排泵活性顯著提高革蘭陰性菌外膜通透性，與喹諾酮類抗生素聯(lián)用時(shí)能夠有效降低銅綠假單胞菌的治療難度[4,5]；部分喹啉衍生物（quinoline）被證明對(duì)于產(chǎn)氣腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌外排泵活性具有抑制作用，研究認(rèn)為其作用機(jī)理可能與其在該菌AcrAB-TolC外排泵洞穴結(jié)構(gòu)中形成空間位阻，從而干擾底物的運(yùn)輸過程有關(guān)[6-9]。此外，許多天然植物成分也具有明顯的細(xì)菌外排泵抑制活性，可以協(xié)同增強(qiáng)抗生素的抗菌作用[10-11]。然而，由于受到穩(wěn)定性、安全性、特異性、藥代動(dòng)力學(xué)特征等問題的限制，現(xiàn)有外排泵抑制劑在有效劑量下通常表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性，目前尚沒有成熟的外排泵抑制劑能夠投入臨床使用，外排泵抑制劑的相關(guān)研究仍有待深入[12-14]。

3 切斷細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)

細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)是一類細(xì)菌通過分泌自誘導(dǎo)物（autoinducers，AIs）與環(huán)境中其他細(xì)菌進(jìn)行通訊，從而特異性調(diào)節(jié)部分細(xì)菌生理學(xué)功能的調(diào)控系統(tǒng)，已被證明廣泛參與細(xì)菌的生物發(fā)光[15]、生物膜形成[16]、毒素釋放[17]、運(yùn)動(dòng)性[18]以及芽孢形成[19]等過程，是影響細(xì)菌多種生命活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一，因此也是新型輔助抗菌藥物研發(fā)的理想作用靶點(diǎn)。

目前已知的細(xì)菌QS系統(tǒng)包括LasI/LasR系統(tǒng)、RhlI/RhlR系統(tǒng)，以及銅綠假單胞菌喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)（Pseudomonasquinolone signal，PQS）等，其中前兩者屬于LuxI/LuxR型，在革蘭陰性菌中的分布最為廣泛[20]。LasI/LasR系統(tǒng)一般依靠細(xì)菌自身合成的3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯（3-O-C12-HSL）或丁基高絲氨酸內(nèi)酯（C4-HSL）作為AI，并在環(huán)境中AI達(dá)到閾值濃度時(shí)刺激轉(zhuǎn)錄激活因子LasR合成AI受體，從而直接或間接完成細(xì)菌基因表達(dá)水平調(diào)控過程?；诖嗽?，有研究對(duì)3-OC12-HSL的五元內(nèi)酯環(huán)和酰胺側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾，從而達(dá)到競(jìng)爭(zhēng)抑制LasR受體，阻斷信號(hào)傳遞的目的[21]；Colleen等發(fā)現(xiàn)溴化硫代內(nèi)酯（meta-bromo-thiolactone）因其結(jié)構(gòu)與3-OXO-C12-HSL相似而能夠同時(shí)阻斷銅綠假單胞菌的LasR和RhlR系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)菌毒性下降[16]；黃酮類化合物可利用其結(jié)構(gòu)中A環(huán)主鏈中的2個(gè)羥基有效抑制銅綠假單胞菌LasR/RhlR系統(tǒng)的活性，生物化學(xué)分析表明黃酮類化合物非競(jìng)爭(zhēng)抑制LasR/RhlR系統(tǒng)與DNA的結(jié)合，從而抑制細(xì)菌毒力因子的產(chǎn)生[22]。此外，部分傳統(tǒng)藥物也被證明對(duì)細(xì)菌QS具有一定的干擾作用。布洛芬能夠有效抑制細(xì)菌的QS系統(tǒng)[23]；阿奇霉素可通過干擾QS系統(tǒng)降低銅綠假單胞菌毒素的產(chǎn)生[24]；氨溴索通過干擾QS系統(tǒng)抑制細(xì)菌生物膜生成[25]；阿司匹林可作為L(zhǎng)asR的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑顯著降低實(shí)驗(yàn)菌株的毒素產(chǎn)量和生物膜形成速度[26]。

細(xì)菌QS系統(tǒng)種類繁多，不僅一種細(xì)菌可同時(shí)編碼多個(gè)QS系統(tǒng)，并且許多細(xì)菌常具有自己獨(dú)特的QS系統(tǒng)，極大地增加了廣譜QS抑制劑的研發(fā)難度。即使是部分已知的QS抑制劑，其有效成分、作用靶點(diǎn)、作用機(jī)制等關(guān)鍵問題也尚未完全清楚，距離成功研發(fā)QS抑制劑并將其廣泛應(yīng)用于臨床仍有很長(zhǎng)的路要走。

4 降低細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)與黏附能力

進(jìn)入宿主體內(nèi)后，細(xì)菌首先須借助自身的運(yùn)動(dòng)與黏附能力定植于特定的組織/細(xì)胞表面，為后續(xù)的感染和增殖提供條件。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的鞭毛結(jié)構(gòu)須由FlaA和FlaB蛋白在九碳糖pseudaminic acid（Pse）的O-連接糖基化修飾作用下才能夠正常組裝并發(fā)揮運(yùn)動(dòng)功能，而Pse的生物合成先后需要 PseB、PseC、PseH、PseG、PseI和 PseF的參與才能完成[27]。Menard等通過高通量篩選與計(jì)算機(jī)模擬相結(jié)合的方式對(duì)Pse合成抑制劑進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)CD24868、CD26839和CD36508等3種小分子物質(zhì)對(duì)于Pse的合成具有劑量依賴性的抑制作用，從而有望降低細(xì)菌的生存能力，及時(shí)被宿主的免疫系統(tǒng)清除[28]。

在革蘭陽性菌中，部分細(xì)菌黏附因子在錨定于細(xì)菌表面肽聚糖層的過程中須借助于分選酶A（sortase A，SrtA）的轉(zhuǎn)肽酶活性，干擾SrtA活性可顯著降低細(xì)菌感染能力，使得SrtA成為一種極具潛力的新型藥物作用靶點(diǎn)[29]。槲皮苷（quercitrin，QEN）是一種來自香柏等中草藥的生物類黃酮化合物，具有抗炎作用，早期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、動(dòng)脈粥樣硬化等具有一定療效[30-31]，Liu等發(fā)現(xiàn)QEN在體外實(shí)驗(yàn)條件下可以有效抑制金黃色葡萄球菌SrtA重組蛋白的活性，細(xì)菌在QEN的作用下對(duì)于纖維蛋白原和纖連蛋白的黏附作用大幅下降[32]。不僅如此，QEN還能通過影響細(xì)菌唾液酸代謝途徑，降低肺炎鏈球菌的生物膜形成能力，其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的效果仍有待證實(shí)[32]。

5 干擾細(xì)菌毒素的生成與釋放

細(xì)菌毒力因子（virulence factors，VF）的生成/釋放效率與感染類疾病發(fā)生的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，應(yīng)用VF抑制劑不僅能夠精準(zhǔn)降低細(xì)菌致病能力、提高患者生生存率，并且由于該類藥物不直接抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、細(xì)菌生存壓力小，因此更不易于誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，是一種較為理想的輔助抗菌手段（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）[33]。

Clp蛋白酶家族廣泛參與金黃色葡萄球菌毒力基因表達(dá)、細(xì)胞壁合成、細(xì)胞分裂等過程，是控制金黃色葡萄球菌VF表達(dá)水平的重要影響因素。Gao等通過gfp-luxABCDE雙報(bào)告質(zhì)粒和金黃色葡萄球菌毒力相關(guān)基因的多重啟動(dòng)子報(bào)告平臺(tái)篩選毒力蛋白小分子抑制物，最終從化學(xué)物質(zhì)文庫中篩選到能夠?qū)⒏咧虏〗瘘S色葡萄球菌逆轉(zhuǎn)為非致病菌株的小分子化合物M21。M21以非競(jìng)爭(zhēng)方式抑制ClpP活性并間接導(dǎo)致細(xì)菌α毒素的表達(dá)水平下降，在小鼠感染模型試驗(yàn)中亦能夠有效減弱受試菌株的毒力，提示該化合物體內(nèi)抑制活性良好，具有較高的臨床研究?jī)r(jià)值[34]。

干擾細(xì)菌VF的釋放過程同樣具有價(jià)值。Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲ secretion systems，T3SS）由多個(gè)蛋白組合而成，其針狀結(jié)構(gòu)能夠?qū)⒓?xì)菌VF注射至宿主細(xì)胞內(nèi)，是大多數(shù)革蘭陰性菌發(fā)揮其毒性的重要工具[35]。T3SS在革蘭陰性菌中高度保守，研究其抑制劑有助于新型輔助抗菌藥物的研發(fā)。目前已知的T3SS抑制物包括8-羥基喹啉衍生物[36]、白藜蘆醇四聚體[37]、2，2′-硫雙（4-甲基苯酚）[38]、柚皮素[39]、甘草黃酮醇[40]等，這些小分子化合物能夠有效抑制T3SS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或針尖結(jié)構(gòu)的組裝，但更為深入的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。能夠同時(shí)針對(duì)T3SS針狀結(jié)構(gòu)蛋白PcrV和胞外脂多糖PsI的雙特異性單克隆抗體MEDI3902可同時(shí)降低銅綠假單胞菌的黏附能力和致病性，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段[41]。

6 噬菌體裂解酶

噬菌體是一類對(duì)于原核生物具有感染能力的病毒，其在感染末期會(huì)通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁的方式破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，以便于成熟噬菌體顆粒的釋放。RNA噬菌體或單鏈DNA噬菌體通過間接干擾宿主菌細(xì)胞壁合成的方式導(dǎo)致細(xì)菌裂解，而雙鏈DNA噬菌體則直接通過合成一種細(xì)胞壁水解酶，即裂解酶或內(nèi)溶素的方式水解宿主菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)。大多數(shù)噬菌體裂解酶同時(shí)具有N端催化結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域的“雙結(jié)構(gòu)域”特點(diǎn)，并根據(jù)其催化結(jié)構(gòu)域的作用位點(diǎn)分為胞壁酸酶（作用于β-1，4-糖苷鍵）、肽鏈內(nèi)切酶（作用于多肽鍵）和酰胺酶（作用于酰胺鍵）等多種類型。

在細(xì)菌耐藥愈發(fā)嚴(yán)重的背景下，噬菌體裂解酶以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而越來越受重視。首先，多項(xiàng)研究表明細(xì)菌對(duì)于噬菌體裂解酶無法產(chǎn)生抗性，這可能與噬菌體和細(xì)菌共同進(jìn)化，其裂解酶經(jīng)演化后能夠高效識(shí)別細(xì)菌特異性位點(diǎn)有關(guān)[42-43]。其次，裂解酶相比抗生素具有更好的特異性。廣譜抗生素在殺傷病原菌的同時(shí)也破壞了原有的微生態(tài)平衡，噬菌體裂解酶的抗菌譜介于抗生素和噬菌體之間，可更好地兼顧抗菌譜與特異性[44]。而且，由于裂解酶直接作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，因此其作用十分迅速，幾秒內(nèi)即發(fā)揮裂解作用，納克級(jí)裂解酶即可使細(xì)菌濁度出現(xiàn)肉眼可見的下降，Obeso等發(fā)現(xiàn)葡萄球菌噬菌體裂解酶LysH5能夠迅速殺死巴氏消毒牛奶中的金黃色葡萄球菌，在4 h內(nèi)將細(xì)菌數(shù)量降低至檢測(cè)限以下[45]，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也具有較為顯著的效果[46]。最為重要的是，噬菌體裂解酶相較于噬菌體本身而言具有極高的安全性，在使用過程中主要關(guān)注由于細(xì)菌裂解所釋放的磷壁酸、肽聚糖等促炎性物質(zhì)所引發(fā)的相關(guān)并發(fā)癥即可[47]。

盡管噬菌體裂解酶仍存在制備和保存條件要求較高、較強(qiáng)的免疫原性、較窄的抗菌譜等缺點(diǎn)，但仍不能改變噬菌體裂解酶作為一種輔助抗菌策略的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平改造噬菌體，使其能夠攜帶一種或多種高效、廣譜的噬菌體裂解酶，從而更好地為臨床提供服務(wù)是今后的研究方向。

7 反義寡核苷酸技術(shù)

反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs）技術(shù)是通過人工合成或構(gòu)建表達(dá)載體制造寡核苷酸片段，從而對(duì)目的基因進(jìn)行抑制、封閉或干擾的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、易于合成、特異性極高、不產(chǎn)生免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在新藥研發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊。目前已應(yīng)用于原核生物的包括反義RNA（asRNA）、反義DNA（asDNA）和核酶等。其中，反義RNA和DNA分子通過與目的mRNA序列互補(bǔ)結(jié)合抑制或封閉目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；而核酶作為一種具有催化功能的小分子RNA，則能夠特異性識(shí)別并剪切目的RNA分子，從而阻斷靶基因的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)條件下，反義寡核苷酸能夠有效干擾細(xì)菌關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，并因此達(dá)到一定的輔助抗菌效果。Jeon等通過抑制空腸彎曲菌外排泵基因CmeABC提高耐藥菌對(duì)環(huán)丙沙星和紅霉素的敏感性[48]；Meng等則利用反義寡核苷酸技術(shù)降低了金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥能力[49]。

近幾年，反義寡核苷酸藥物迎來了高速發(fā)展期，近3年來由美國(guó)FDA批準(zhǔn)的各類反義寡核苷酸藥物就多達(dá)6種。除輔助細(xì)菌感染治療以外，寡核苷酸藥物多用于一些罕見、疑難疾病的治療，有望填補(bǔ)部分疾病治療方案的空白[50]。然而，反義核酸技術(shù)在臨床應(yīng)用中仍面臨藥物遞送效率和體內(nèi)穩(wěn)定性兩大技術(shù)瓶頸。位于體內(nèi)環(huán)境中的寡核苷酸片段具有穩(wěn)定性差、易降解、難以進(jìn)入細(xì)胞等缺點(diǎn)，因此常需要對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾以提高穩(wěn)定性，常見的修飾方式包括硫代磷酸脫氧寡核苷酸（phosphorothioate oligodeoxynucleotide，PS-ODN）、磷酰二胺嗎啉反義寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMO）和肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）等，這一方面有效增強(qiáng)了寡核苷酸藥物對(duì)核酸酶的抵抗能力，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，但也一定程度上導(dǎo)致了藥物親和力的下降、體內(nèi)炎癥反應(yīng)等問題[51]。因此在未來幾年內(nèi)，如何將反義寡核苷酸藥物有效導(dǎo)入細(xì)菌并使其在細(xì)菌體內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮抑制作用，從而削弱細(xì)菌的耐藥/生存能力，仍是反義技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵方向。

8 結(jié)語

抗生素的廣泛應(yīng)用曾拯救了無數(shù)感染患者的生命，是20世紀(jì)最偉大的醫(yī)學(xué)發(fā)明之一。然而依據(jù)進(jìn)化論基本原理，其大量使用將不可避免地導(dǎo)致細(xì)菌在篩選壓力下進(jìn)化出相關(guān)耐藥特性。伴隨著近年來抗生素濫用情況的加劇、傳統(tǒng)抗生素研發(fā)進(jìn)展進(jìn)入瓶頸期等問題，臨床多重耐藥細(xì)菌比例正逐年上升，可供臨床醫(yī)生使用的相關(guān)抗菌藥物正逐漸減少，世界正逐步走向“后抗生素時(shí)代”。因此，研發(fā)新型抗菌藥物以滿足日益急切的臨床需求成為迫在眉睫的重要問題。然而，由于受到目前技術(shù)手段的限制，發(fā)現(xiàn)一種具有全新作用機(jī)制的傳統(tǒng)抗生素難以實(shí)現(xiàn)，因此從新思路、新角度入手，通過降低細(xì)菌毒性、削弱細(xì)菌生存性或干擾耐藥基因表達(dá)等輔助抗菌手段降低多重耐藥細(xì)菌的治療難度正越來越受到人們的重視。本文對(duì)部分具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的輔助抗菌策略進(jìn)行了歸納和總結(jié)，這些新興抗菌策略雖然目前尚難進(jìn)入臨床應(yīng)用，但伴隨著未來技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，將有望成為能夠顯著提高傳統(tǒng)抗生素抗菌效果的新型輔助抗菌手段，為研發(fā)新一代抗菌藥物爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。