細(xì)胞短期凍存液的優(yōu)化研究

王雨琪，鄭幽，蔣曉祎，孫強(qiáng)，江紅

1.北京交通大學(xué) 理學(xué)院生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

細(xì)胞培養(yǎng)和保種技術(shù)廣泛用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如疫苗研制、人工器官和再生醫(yī)學(xué)等。冷凍保存是目前細(xì)胞長期保存的通用方法，有利于降低細(xì)胞被微生物污染和細(xì)胞之間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且能夠減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變，避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。然而，細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇過程會(huì)對(duì)細(xì)胞造成較大損傷，降低細(xì)胞膜中的脂質(zhì)含量，產(chǎn)生過氧化，同時(shí)影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝途徑[1-3]。因此，凍存液作為細(xì)胞在低溫狀態(tài)下的保護(hù)介質(zhì)，其作用尤為重要。

自Polge等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凍存液中添加甘油可提升細(xì)胞復(fù)蘇后的存活數(shù)量，越來越多的實(shí)驗(yàn)致力于研究細(xì)胞的低溫保護(hù)。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）就是細(xì)胞低溫保護(hù)介質(zhì)中的一種，DMSO可以有效降低細(xì)胞內(nèi)的水分子含量，從而降低結(jié)晶形成的概率，減少細(xì)胞損傷[4-5]。目前應(yīng)用最廣的細(xì)胞凍存液是DMSO與胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的混合溶液，然而FBS價(jià)格昂貴，不適宜大量凍存使用。

本研究旨在探討細(xì)胞短期凍存液的優(yōu)化配方。我們以多種貼壁細(xì)胞及懸浮細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察分析不同血清含量的凍存液對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇狀態(tài)和生長速度可能存在的影響，為細(xì)胞培養(yǎng)和留種等操作提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

貼壁細(xì)胞系人乳腺癌上皮細(xì)胞株MCF-7和人鼻咽上皮細(xì)胞株NP-69，懸浮細(xì)胞系人急性白血病淋巴細(xì)胞株CCRF、人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat和人慢性髓原白血病細(xì)胞K-562細(xì)胞株均由本課題組保存；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購自Macgene公司；胎牛血清購自康源公司；DMSO購自北京伊諾凱科技有限公司；臺(tái)盼藍(lán)購自Procell公司。

1.2 凍存液配制

按不同配比（體積分?jǐn)?shù)）配制細(xì)胞凍存液［A組：10%DMSO+10%FBS+80%DMEM/1640培養(yǎng)基；B組：10%DMSO+20%FBS+70%DMEM/1640培養(yǎng)基；C組：10%DMSO+50%FBS+40%DMEM/1640培養(yǎng)基；D組：10%DMSO+90%FBS］，吹打混勻后于4℃保存。

1.3 貼壁細(xì)胞凍存

取正常連續(xù)培養(yǎng)且狀態(tài)良好的貼壁細(xì)胞，棄去上清，用PBS沖洗2～3次，加入胰蛋白酶于37℃消化完全后取出，用含10%FBS及1%青鏈霉素混合液的DMEM混合培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，將中和后的混合液分為4組并以1000 r/min離心收集細(xì)胞，分別用不同配比的凍存液重懸，放入程序降溫盒中（平均降溫速率-1℃/min），-80℃凍存。

1.4 懸浮細(xì)胞凍存

1000 r/min低速離心收集正常連續(xù)培養(yǎng)且狀態(tài)良好的懸浮細(xì)胞，棄上清后用PBS重懸，分為4等份后再次離心收集細(xì)胞，分別用不同配比的凍存液重懸，放入程序降溫盒中，-80℃凍存。

1.5 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

-80℃凍存4 d后，取出程序降溫盒中的凍存管迅速放到預(yù)熱至37℃的水浴鍋中，融化完全后分別離心，棄去凍存液，分別以適量含10%FBS及1%青鏈霉素的DMEM和1640混合培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞正常狀態(tài)下不同的生長速度，分別取NP-69、Jurkat和K-562細(xì)胞5×104個(gè)，MCF-7和CCRF細(xì)胞1×105個(gè)接種于12孔板，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

用倒置熒光顯微鏡在20×鏡下分別拍攝復(fù)蘇后24、30、48、72、96 h時(shí)細(xì)胞的生長狀態(tài)，對(duì)比貼壁細(xì)胞的貼壁情況及懸浮細(xì)胞的成團(tuán)情況，以及視野中細(xì)胞碎片和雜質(zhì)的數(shù)量。

1.7 細(xì)胞增殖速率分析

細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，以DMEM混合培養(yǎng)基中和，1000 r/min離心3 min，棄上清，制備單細(xì)胞懸液。懸浮細(xì)胞連同培養(yǎng)基吸出后1000 r/min離心3 min，同樣棄去上清制備單細(xì)胞懸液。取9 μL細(xì)胞懸液加入1 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液至終濃度0.04%，染色3 min后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，記錄活細(xì)胞數(shù)目。以上述同種方法在復(fù)蘇培養(yǎng)后48、72、96 h分別重復(fù)1次臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 不同配方的凍存液對(duì)貼壁細(xì)胞短期凍存后生長形態(tài)的影響

細(xì)胞復(fù)蘇24 h后，D組MCF-7細(xì)胞貼壁能力稍差，A、B組復(fù)蘇后貼壁能力較好。30 h后，A組細(xì)胞貼壁效果明顯優(yōu)于其他3組，48 h后4組細(xì)胞基本全部貼壁，視野中無明顯細(xì)胞死亡，截至96 h，4組細(xì)胞復(fù)蘇后的形態(tài)及大小無明顯差異（圖1A）。類似地，NP-69細(xì)胞復(fù)蘇后，A組貼壁效果較好于其他3組，且在D組觀測(cè)到少量細(xì)胞碎片，96 h內(nèi)4組細(xì)胞復(fù)蘇后的形態(tài)及大小也無明顯差異（圖1B）。提示，對(duì)于貼壁細(xì)胞的短期凍存，凍存液中不同血清含量對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響，低濃度血清含量（10%）即可維持短期凍存時(shí)貼壁細(xì)胞的生長活力。

圖1 貼壁細(xì)胞在96 h內(nèi)的生長狀態(tài)

2.2 不同配方的凍存液對(duì)貼壁細(xì)胞短期凍存后增殖能力的影響

根據(jù)0、24、48、72和96 h記錄的細(xì)胞數(shù)目繪制生長曲線，結(jié)果如圖2，MCF7和NP-69細(xì)胞在用不同配方的凍存液短期凍存后，細(xì)胞生長速度無明顯差異，提示，對(duì)貼壁細(xì)胞的短期凍存，凍存液中血清含量的變化對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響，低濃度的血清含量（10%）即可維持短期凍存時(shí)貼壁細(xì)胞的增殖能力。

圖2 貼壁細(xì)胞在96 h內(nèi)的生長速度

2.3 不同配方的凍存液對(duì)懸浮細(xì)胞短期凍存后生長形態(tài)的影響

復(fù)蘇24 h后拍照觀察，4組均有懸浮細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團(tuán)，但隨著血清濃度降低，復(fù)蘇后細(xì)胞死亡增多，細(xì)胞狀態(tài)變差，細(xì)胞碎片增多。單獨(dú)的懸浮細(xì)胞形態(tài)圓潤，無明顯差異，而不同的懸浮細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)差異較大。

低血清濃度（A、B組）凍存液中復(fù)蘇的CCRF細(xì)胞易形成較大細(xì)胞團(tuán)，隨著細(xì)胞死亡增多，漂浮的細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞團(tuán)數(shù)量減少，高血清濃度（C、D組）凍存液中復(fù)蘇的CCRF細(xì)胞則較少形成大細(xì)胞團(tuán)（圖3A）。相反，高血清濃度凍存的Jurkat細(xì)胞在復(fù)蘇后較易形成細(xì)胞團(tuán)，且成團(tuán)細(xì)胞數(shù)量較高于低濃度組（圖3B）。而K-562細(xì)胞中少見大細(xì)胞團(tuán)，多為20個(gè)細(xì)胞以內(nèi)的較小細(xì)胞團(tuán)，且在高血清濃度凍存液中復(fù)蘇的K-562細(xì)胞有較多小細(xì)胞團(tuán)形成（圖3C）。

圖3 懸浮細(xì)胞在96 h內(nèi)的生長狀態(tài)

結(jié)果提示，對(duì)于懸浮細(xì)胞的短期凍存，凍存液中不同血清含量對(duì)細(xì)胞活力影響顯著，高濃度血清含量對(duì)維持短期凍存時(shí)懸浮細(xì)胞的生長活力有著關(guān)鍵作用，F(xiàn)BS∶DMSO為9∶1的比例最優(yōu)。

2.4 不同配方的凍存液對(duì)懸浮細(xì)胞短期凍存后增殖能力的影響

如圖4所示，用90%血清凍存液凍存的CCRF細(xì)胞（D組）在復(fù)蘇后96 h內(nèi)，其生長速度和數(shù)量明顯優(yōu)于其他配方。在Jurkat和K-562細(xì)胞中，高血清濃度的凍存液（C、D組）效果也優(yōu)于低血清濃度凍存液（A、B組）。復(fù)蘇后48 h內(nèi)，C組中Jurkat和K-562細(xì)胞生長速度最快，截至復(fù)蘇后96 h，D組中Jurkat和K-562細(xì)胞增殖數(shù)量最多。

圖4 懸浮細(xì)胞在96 h內(nèi)的生長速度

結(jié)果提示，對(duì)懸浮細(xì)胞的短期凍存，凍存液中血清含量的變化對(duì)細(xì)胞增殖有顯著影響，血清含量越高越利于維持懸浮細(xì)胞短期凍存時(shí)的增殖能力，F(xiàn)BS∶DMSO為9∶1的比例最優(yōu)。

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)是大量實(shí)驗(yàn)開展的基礎(chǔ)，建立安全有效的凍存及復(fù)蘇方法是細(xì)胞培養(yǎng)的前提和基礎(chǔ)。為了減少胎牛血清的潛在風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)約經(jīng)費(fèi)，同時(shí)保證理想的凍存與復(fù)蘇效果，本研究配置了4種不同血清濃度的凍存液并進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于貼壁細(xì)胞，凍存液中的血清含量對(duì)復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)及生長增殖無明顯影響；而對(duì)于懸浮細(xì)胞，隨著血清濃度降低，復(fù)蘇后細(xì)胞生長增殖能力明顯減弱。綜上，對(duì)于貼壁細(xì)胞的短期凍存與復(fù)蘇，出于節(jié)約和風(fēng)險(xiǎn)性考慮，推薦使用10%血清含量的凍存液；而對(duì)于懸浮細(xì)胞的短期凍存與培養(yǎng)，出于保證實(shí)驗(yàn)效果的考量，推薦使用90%血清含量的凍存液。

除血清外，不同保護(hù)劑種類和降溫方式均有可能影響細(xì)胞凍存和復(fù)蘇效果。相對(duì)于非滲透性凍存保護(hù)劑，DMSO作為目前應(yīng)用最廣泛的滲透性保護(hù)劑，能有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水的玻璃化，降低細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶造成的細(xì)胞損傷。然而，細(xì)胞凍存的降溫過程水分子會(huì)產(chǎn)生極性運(yùn)動(dòng)，在冷凍過程中細(xì)胞需充足的時(shí)間失水以防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，同時(shí)也應(yīng)避免降溫時(shí)間過長造成的細(xì)胞嚴(yán)重脫水損傷，因此在細(xì)胞凍存降溫過程中存在最佳降溫速率。目前程序性降溫液氮凍存法已得到廣泛應(yīng)用，本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用程序降溫盒，以-1℃/min的平均降溫速率進(jìn)行緩慢降溫，此外也可以采用分階段降溫措施，將降溫速率控制在-1～-1.5℃/min，從而減少細(xì)胞損傷[6-7]。

需要注意的是，本次實(shí)驗(yàn)旨在探究短期凍存中凍存液對(duì)細(xì)胞的影響，凍存時(shí)間較短，細(xì)胞的選擇也較有針對(duì)性，因此不能完全用于推斷和模擬長期凍存對(duì)不同細(xì)胞的影響和損傷。此外，有研究證明用10%、20%、40%和90%血清含量的凍存液在-80℃短期凍存的干細(xì)胞，可達(dá)到與-196℃液氮低溫凍存相同的效果，同時(shí)更加簡便快捷[8]，但是否適用于懸浮細(xì)胞仍不明確。

綜上所述，我們分別探討了不同配比的凍存液在短期凍存中對(duì)貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的影響，含有90%血清的凍存液在短期凍存中能更好地保護(hù)懸浮細(xì)胞，而凍存液中的血清含量對(duì)于貼壁細(xì)胞影響不大。這一結(jié)果可為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)和留種等操作提供指導(dǎo)。