香米特征香味成分2-乙?；?1-吡咯啉提取及檢測方法研究進展

胡亞微, 楊 洋, 彭錦峰

(1. 陜西科技大學化學與化工學院, 陜西 西安 710021; 2. 西安交通大學食品裝備工程與科學學院, 陜西 西安 710049)

大米是亞洲人口的主要糧食作物之一,隨著生活水平的提高,具有優(yōu)質香味的香米更被消費者所青睞。香米的主要生產國是印度、巴基斯坦和泰國,印度和巴基斯坦出口的香米主要是巴斯馬蒂米(basmati rice),而泰國主要出口茉莉香米(jasmine rice)[1],我國生產的香米最廣為人知的是五常稻花香米。自1982年Buttery等[2]確定2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,簡稱2-AP)是香米香味的主要成分以來,無論是在食品貿易領域對于該化合物的精準檢測[3],還是在農業(yè)領域關于選育和調控高含量2-AP稻米的研究[4-7],以及在食品加工領域如何使香米的香味成分能夠持久保持[8]或是開發(fā)出高穩(wěn)定性的具有米香氣味的食品風味成分[9,10],都一直是研究人員所關注的熱點。2-AP是一種沸點較低的小分子雜環(huán)化合物,其相對分子質量為111.14,作為食品中主要的香味化合物之一,具有烤面包、堅果、爆米花的香氣,相關研究表明它在空氣中具有極低的氣味閾值(0.02 ng/L)[11],即使在香米中含量極低都很容易被人類嗅覺系統(tǒng)所感知。

天然香米中2-AP的含量通常低至微克每千克,Wakte等[3]報道的不同種類香米中2-AP含量范圍為0.2～2 746 μg/kg, Wei等[12]報道的香米精米中2-AP含量范圍與Wakte報道的類似,他們還特別指出香米糙米中2-AP的含量為100～760 μg/kg。由于該化合物含量的高低直接影響香米香味濃郁程度和價格[13],因此,在大米進出口貿易過程中,如何準確測定這種特征性香味成分就顯得尤為重要。但在實際樣品的測定過程中,對大米樣品進行必要的蒸餾、萃取等前處理時,通常需要在較高溫度下進行,從而導致前處理過程中可能會有2-AP的損失或新的2-AP生成[14];在采用氣相色譜等現(xiàn)代分析檢測儀器進行測定時,分離過程中共流出物的干擾或是同分異構體的影響[15,16]會使獲取準確的測定結果具有相當?shù)碾y度。目前,常用的樣品前處理方法主要有減壓蒸餾或水蒸氣蒸餾等蒸餾法(distillation)、同時蒸餾萃取法(SDE)、有機溶劑萃取法、超臨界流體萃取法(SFE)、頂空或頂空吸附萃取法(HSSE)、固相微萃取法(SPME)等。常用的檢測方法主要有氣相色譜(GC)法或氣相色譜-質譜(GC-MS)法、氣相色譜-嗅覺測試(GC-olfactory, GC-O)法、高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)法等。本文主要介紹香米中特征性香味成分2-AP分析測定時的樣品前處理和儀器分析方法研究進展,為相關領域開發(fā)精準、快速、高效的2-AP檢測方法提供參考。

1 樣品前處理方法

1.1 蒸餾法

減壓蒸餾法(又稱真空蒸餾)通過減少裝置內的壓力而降低液體的沸點,在較低的溫度下即可收集到樣品餾分,可以有效地避免餾分分解。早在1978年,Withycombe等[17]將2 kg香米和6 L飽和氯化鈉溶液在45 ℃下減壓蒸餾4.5 h,成功地從香米中提取出2-AP。但是減壓蒸餾法通常需要的蒸餾時間較長,且操作過程中對壓力控制要求較高,控制不當時容易導致蒸餾失敗。而水蒸氣蒸餾法是提取植物樣品中香味成分最常見的方法之一。將樣品在水中浸泡后,直接進行蒸餾,樣品中的揮發(fā)性成分隨水蒸氣餾分一并帶出,經過冷凝管冷凝后,即可在裝置末端收集到揮發(fā)性成分。1986年,Buttery等[18]利用水蒸氣蒸餾法,將200 g香米和6 L水蒸餾2 h后,用酸化的乙醚萃取收集的餾分,結合相應的儀器分析手段,最終對4種不同類型香米中的2-AP進行定量分析。1988年,Buttery等[19]用類似的方法,對64種煮熟的香米中的化合物進行定量分析,并確定了它們在水溶液中的氣味閾值,其中2-AP的閾值為0.1 μg/L。直到2006年,Nadaf等[20]仍然采用減壓條件下對200 g香米糙米樣品進行水蒸氣蒸餾,再用二氯甲烷對收集的水蒸氣冷凝物進行萃取,并進一步濃縮、干燥后進行儀器分析測定,測得幾種香米中2-AP的含量范圍是0.028～0.061 mg/kg。

1.2 同時蒸餾萃取法

SDE法是將樣品蒸氣與萃取溶劑的蒸氣在同一個密閉裝置內混合,沸點較低的揮發(fā)性成分首先被蒸餾出來后,立即被萃取溶劑的蒸氣在冷凝管上萃取。SDE法將水蒸氣蒸餾和溶劑萃取的過程合二為一,與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法相比,減少了實驗步驟,降低了樣品在轉移過程中的損失。Buttery等[21]利用SDE法對10種不同類型香米中的2-AP進行萃取,他們將500 g香米與6 L水混合進行蒸餾,同時用乙醚作萃取溶劑,在高溫下萃取2 h,再進入相應的儀器完成檢測。結果顯示,10種香米中2-AP的含量為0.006～0.09 mg/kg。1991年,Tanchotikul等[22]對SDE法的裝置進行改進,設計了一種新型的微量SDE法,該方法僅需1 g香米和100 mL蒸餾水,就可以實現(xiàn)香米中2-AP的提取。但是SDE法在提取過程中一般要求較高的操作溫度,對于揮發(fā)性較強的香味成分,可能會造成一定損失。

1.3 溶劑萃取法

溶劑萃取法是利用樣品中各組分在特定溶劑中的溶解性質差異,從而達到分離的效果。Wijit等[23]先用鹽酸溶液對泰國水稻種子中的揮發(fā)性成分進行提取,再用二氯甲烷反萃取,GC-MS分析,共檢測出35種揮發(fā)性成分。應興華等[24]用體積比為1∶1的無水乙醇-二氯甲烷為萃取劑,在80 ℃下對11份香稻育種材料中的2-AP進行了萃取,萃取3 h后將萃取液進行GC-MS分析,測得2-AP的含量為0.045～0.699 mg/kg。Hien等[25]則直接用400 mL純乙醇為萃取溶劑,將100 mg經研磨的稻米樣品在70 ℃下萃取2 h,高速離心后,上清液直接進行GC-MS測定,測得36個香米中2-AP含量為0～430.7 μg/kg。溶劑萃取法步驟簡單、操作方便,但有時受基質影響嚴重,容易造成結果失真。Laohakunjit等[26]用超臨界流體萃取、同時蒸餾萃取和有機溶劑萃取3種方法萃取了用于給米飯增香的香蘭葉中的2-AP,結果表明,采用乙醇浸泡萃取測得2-AP的含量為 2 771 μg/kg,這一結果是采用其他兩種萃取方法獲得結果的4倍多,研究人員認為,這可能與香蘭葉中的色素溶于乙醇有很大關系,復雜基質干擾造成了測定結果偏高。

1.4 超臨界流體萃取法

SFE是目前國際上較先進的物理萃取技術,該方法通過改變壓力或溫度使超臨界流體密度大幅改變,在超臨界狀態(tài)下,讓超臨界流體與待萃取物質接觸,使其選擇性地將不同性質的成分萃取出來。CO2因為其安全無毒、價格低廉等特點,是超臨界流體萃取中最常用的萃取劑。Laohakunjit等[26]采用超臨界CO2流體萃取法,在20 MPa、50 ℃條件下,對用于給大米增香的香蘭葉萃取了20 min。結果表明,香蘭葉中2-AP的含量為716 μg/kg,而提取時間更久的SDE,提取的2-AP的含量僅為1.5 μg/kg,測定結果明顯偏低主要是由于萃取過程中加熱導致2-AP的損失。

1.5 頂空法或頂空吸附萃取法

頂空法(頂空直接進樣分析法)是將樣品加熱后,直接收集樣品頂空氣體進行分析的一種方法。Limpawattana等[27]將100 g大米加入150 mL蒸餾水蒸煮,收集70 ℃時產生的頂空氣體,再通過活性炭柱凈化,隨后全部進入Tenax捕集器進行捕集,捕集器中的氣體在氣相色譜儀進樣口熱解吸池中于250 ℃解吸5 min后,先通過一段3 cm長的冷阱柱,該冷阱柱由CO2冷卻,溫度設定為-40 ℃,這樣可以使氣體先冷凝下來,達到聚集的效果,再快速升溫至200 ℃,進入后續(xù)的GC測定。通過這種方法,研究人員對韓國13種特色大米的揮發(fā)性成分進行了分析,成功鑒定出了特征性香味成分2-AP。Sriseadka等[15]采用靜態(tài)頂空直接進樣結合GC分析,測定了大米樣品于120 ℃條件下加熱9 min后頂空氣體中2-AP的含量。HSSE與SPME非常相似,都依賴于樣品、頂部空間和吸附裝置上的涂層三者之間的平衡,但HSSE的吸附容量是SPME的50倍,這也意味著它需要更久的時間來達到平衡。Grimm等[28]采用HSSE、在40 ℃下,對1 g香米樣品吸附萃取4 h,實現(xiàn)了香米中2-AP的分離分析。

1.6 固相微萃取法

SPME是基于涂有固定相的熔融石英纖維來吸附、富集樣品中待測物質的一種樣品前處理方法。該方法集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體,前處理速度快,采用頂空萃取模式時基質干擾相對較小,是目前常見的食品中揮發(fā)性成分分析前處理方法之一。Laguerre等[29]采用SPME與MS直接分析相結合的方法,無需色譜柱對萃取物質進行分離,通過多變量分析,構建了質量傳感器,用于快速區(qū)分香米和非香米。Lee等[30]則利用頂空固相微萃取(HS-SPME)對無菌包裝即食香米飯中的2-AP進行了萃取,發(fā)現(xiàn)2-AP的加標回收率低于10% ,其主要原因是樣品基質的影響,為解決這一問題,作者采用標準加入法制作校正曲線,實現(xiàn)了即食米飯中2-AP的精確測定,并建議采用同位素內標法以簡化校正曲線制作過程。

在實際應用過程中,SPME方法的萃取效果除受到樣品基質影響外,還可能受到纖維涂層類型、萃取溫度、萃取時間等多方面因素的影響[31]。常用的商品化SPME纖維涂層材料主要有聚苯胺(PA)、碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)、碳分子篩/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(CAR/DVB/PDMS)等。早在2001年,Grimm等[32]采用SPME對米粒中的2-AP進行了萃取分析。研究人員通過優(yōu)化萃取時間、萃取溫度及樣品加水量3個因素,最終選擇在0.75 g米粒中加入100 μL水,80 ℃條件下,穩(wěn)定25 min,使用CAR/DVB/PDMS纖維萃取15 min而獲得最佳萃取效果。Akhoundzadeh等[33]比較了4種常用的固相微萃取纖維在頂空萃取模式下對香味成分的萃取效果,發(fā)現(xiàn)CAR/DVB/PDMS纖維相對于PA、CAR/PDMS和DVB/PDMS纖維而言,具有更高的萃取容量。Xie等[34]選擇CAR/DVB/PDMS纖維,通過條件優(yōu)化,結合后續(xù)的儀器分析方法,對單粒香米中的2-AP含量進行了測定。該方法的LOD和LOQ分別是1.0 μg/kg 和4.0 μg/kg。Dias等[35]選擇同樣的纖維對2.5 g研磨過的香米中包括2-AP在內的多種揮發(fā)性成分進行萃取,結合GC-MS測定和主成分分析結果,實現(xiàn)不同類別香米的區(qū)分。

Ghiasvand等[36]在對不同香稻中揮發(fā)性成分分析時,對固相微萃取裝置進行了改進。他們認為,高溫雖然可以加快待測物的分子擴散速度,有利于縮短達到平衡所需的時間,但同時也會降低纖維和待測物之間的分配系數(shù),從而降低纖維涂層對待測物的吸附量。因此,他們在萃取的同時,通入二氧化碳冷卻纖維,提高纖維和待測物之間的分配系數(shù),最終提高了纖維的吸附容量。Hopfer等[14]在對單粒香米中的2-AP進行測定時發(fā)現(xiàn),CAR/DVB/PDMS纖維萃取效果雖然比DVB/PDMS纖維好,但解吸附后會有少量殘留,對痕量測定有一定的影響。因此他們選擇DVB/PDMS纖維進行方法優(yōu)化,所建立方法的線性范圍為53～5 380 ng/kg。但是SPME受纖維涂層種類的限制,而目前商品化的涂層有限,且一些涂層在高溫下穩(wěn)定性不好,因此導致結果的重現(xiàn)性難以令人滿意[31]。此外,相關研究還表明,采用SPME方法萃取樣品中的2-AP,萃取到纖維上的總量只占到樣品中2-AP總量的0.3%[32],這對于在樣品中實際含量只有微克每千克水平的2-AP來說,想要獲得精確測定結果,對測定儀器的靈敏度和穩(wěn)定性要求都很高。根據(jù)Ouyang等[37]的報道,隨著近年來新型SPME涂層研制速度的加快、預平衡萃取理論及自動化SPME裝置的應用,以及通過研磨、鹽析、調節(jié)樣品酸度等多種途徑改善樣品基質的影響,SPME在食品中風味成分的分析方面,穩(wěn)定性和精確性已經得到顯著提高。胡翠英等[38]制備了一種Nafion和聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDAC)復合SPME新涂層,測定2-AP時LOD可達0.10 ng/mL。孫謙等[39]利用自動化SPME裝置與GC-MS聯(lián)用,通過測定香米中2-AP含量可快速鑒別香米真?zhèn)?方法的重現(xiàn)性較好。

綜上可知,對于香米特征性香味成分2-AP分析測定的樣品前處理方法,傳統(tǒng)的需要使用多達幾千克樣品并且耗費大量時間和有機試劑的蒸餾法、溶劑萃取法等方法將逐漸被綠色環(huán)保、消耗樣品及試劑更少的超臨界流體法、頂空法或固相微萃取法所取代。特別是自動化固相微萃取技術的進一步發(fā)展成熟以及與儀器在線聯(lián)用的便利性、新型性能更加穩(wěn)定的固相微萃取纖維的研制等,將使得固相微萃取技術成為對樣品中2-AP進行高效萃取分離的有效手段之一。

2 檢測方法

2.1 氣相色譜和氣相色譜-質譜法

GC常用于分析低沸點、小分子、弱極性化合物。由于2-AP的物理化學性質特別適合采用GC分析檢測,自該物質被鑒定為香米的特征性香味成分以來,大多數(shù)的測定都是基于GC分離再結合FID、NPD、MS等檢測器進行檢測而完成的。在分離柱的選擇上,盡管大多數(shù)情況下通用型的色譜柱即可實現(xiàn)樣品中2-AP組分的分離,但考慮到2-AP本身的極性特點,采用WAX柱等極性較強的色譜柱對于復雜基質樣品中2-AP的分離效果較非極性柱要好一些。Hien等[25]采用60 m長的WAX毛細管柱,實現(xiàn)了大米乙醇提取液中2-AP的高效分離。Sriseadka等[15]采用GC分離,研究了火焰離子化檢測器(FID)和氮磷檢測器(NPD)對2-AP的響應情況。結果表明,使用FID時,2-AP的LOD為20 ng;而使用NPD,其LOD可達5 ng。NPD相對于FID雖然可獲得更高的靈敏度,但采用NPD時,對于頂空直接進樣分析,要求樣品中的水分含量不能高于14%[40]。

由于MS具有靈敏度高、定性能力強等特點,因此常用于大米中2-AP的測定。Akhoundzadeh等[33]將HS-SPME和GC-MS聯(lián)用,通過Plackett-Burman設計實驗方法,對香米中的香味成分進行鑒定,從伊朗南部的一種香米中鑒定出了包括2-AP在內的123個成分。Mahmud等[41]則采用HS-SPME結合GC-MS方法,研究了研磨過程對于包括2-AP在內的多種香味成分測定的影響。由于采用GC分離時,樣品基質中與2-AP性質相似的化合物可能會與2-AP共流出;此外,2-AP的同分異構體也無法通過GC進行有效分離,這兩種情況都對準確測定結果的獲取造成很大影響。研究人員除采用常規(guī)的GC-FID/NPD或GC-MS方法外,還采用氣相色譜-飛行時間質譜法(GC-TOF-MS)、全二維氣相色譜-飛行時間質譜法(GC×GC-TOF-MS),或是氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)對樣品中的2-AP進行測定。Ghiasvand等[36]采用冷纖維SPME結合GC-TOF-MS測定了伊朗香米中2-AP的含量,能夠準確快捷地識別出樣品中的2-AP; Sansenya等[42]則用HS-SPME結合GC-MS/MS的方法,研究了泰國本土香米中2-AP的含量、生物相關化合物等與香味程度之間的相關性。Hopfer等[14]利用HS-SPME-GC-MS/MS方法實現(xiàn)了單粒米中2-AP的精確定量。Daygon等[16]則采用GC×GC-TOF-MS方法從代謝組學和基因組學角度揭示了香米呈現(xiàn)香味的機理,并鑒定出和2-AP具有相似香味的同分異構體6-甲基-5-氧代-2,3,4,5-四羥基吡啶(6M5OTP)。

2.2 氣相色譜-嗅覺測定法

GC-O是將嗅覺分辨和儀器檢測結合起來的分析技術。GC將試樣組分分離開,嗅辨員通過嗅探口對聞到的氣味進行描述并記錄,進而獲得樣品的氣味特征。該方法的優(yōu)點是能夠識別出和基質組分共流出的氣味組分,更加直觀地描述氣味特征。Yang等[43]采用動態(tài)頂空和GC-O法,對6種不同類型香米的香味成分進行了研究。評估出25種主要的氣味化合物,并確定了它們在空氣中的氣味閾值,其中2-AP的閾值最低(0.02 ng/L)。Maraval等[44]通過GC-O法,將產自法國的兩種香米與亞洲的一種典型香米進行比較,共得到了40種氣味成分化合物,其中2-AP是3種香米中共有的特征性成分。張敏等[45]利用GC-O-MS方法分析了秈米和粳米等不同稻米蒸煮成米飯的不同風味,在秈米為原料的米飯中未檢出2-AP。

2.3 電子鼻測定法

電子鼻(E-nose)又稱氣味掃描儀,主要由氣敏傳感器陣列、信號預處理和模式識別3部分組成。它以特定的傳感器和識別模式,快速識別樣品中的氣味。相對于傳統(tǒng)人工嗅覺技術,該技術借助模式識別等人工智能手段,克服了因嗅辨員的主觀評判可能導致的重復性不好的問題。Timsorn等[46]通過電子鼻技術和主成分分析法,對香米中摻雜的普通大米含量進行評估,其線性關系(r2)> 0.94。Serafico等[47]采用類似的方法,對不同類型的菲律賓香米品種進行區(qū)分,準確度達到95% 。這些電子鼻測定法,無論是對香米摻雜的分析,還是對不同類型香米的區(qū)分,其所依據(jù)的主要成分之一便是香米特征性香味成分2-AP。

2.4 液相色譜-串聯(lián)質譜法

GC分離分析雖然對沸點低、相對分子質量較小的2-AP有較大的優(yōu)勢,但該分析方法通常需要與高溫蒸餾或高溫萃取等樣品前處理方法相結合,而由于2-AP本身的熱不穩(wěn)定性且在高溫條件下可由還原糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應而生成的特性[14,48],使得采用GC相關的分析測定法會因前處理過程中2-AP的損失或是新生成而影響測定結果的準確性。與GC分離分析相比,LC對待測物的沸點、熱穩(wěn)定性等要求較低。Jost等[48]采用pH 7.4的磷酸緩沖液為提取試劑,對香米等食品中的2-AP進行超聲提取后,以鄰苯二胺為衍生試劑進行衍生化反應,生成穩(wěn)定性較好的2-乙酰基-1-吡咯啉喹喔啉(2-APQ)衍生產物,通過加入2-APQ-d4同位素內標,進行穩(wěn)定同位素稀釋法校正,HPLC-MS/MS測定。該分析方法在樣品提取的過程中,只需要在室溫條件下進行,2-AP不會因發(fā)生降解而損失,避免了由此引起的測定結果不準確的問題。方法的LOD和LOQ分別為0.26 μg/kg 和0.79 μg/kg。利用該方法,Jost等測定了11個巴斯馬蒂米樣品,2-AP含量為41～356 μg/kg。該方法唯一的不足是衍生化反應需要在避光條件下反應24 h?；赗ungsardthong等[49]的研究結果(2-AP在乙醇中于14天內能夠保持較好的穩(wěn)定性)以及Hien等[25]直接以純乙醇為溶劑成功實現(xiàn)大米中2-AP提取的經驗,我們開發(fā)了超聲輔助-乙醇提取-超高效液相色譜-MS/MS法測定香米中2-AP的方法,該方法無需對2-AP進行衍生,即可獲得準確可靠的測定結果,相關研究結果待正式發(fā)表。

綜上所述,GC分離分析仍是2-AP檢測的主流方法,特別是具有更強分離能力和定性能力的多維色譜與串聯(lián)質譜及飛行時間質譜的組合應用,將使得復雜樣品基質中2-AP的檢測結果更加準確;而新型基于衍生化反應的HPLC-MS/MS分析方法的應用,將可有效解決采用GC分析檢測時2-AP在高溫條件下前處理過程中損失或新生成的問題;電子鼻測定法和嗅覺測定法由于本身靈敏度的限制,在實際應用過程中大多需要和質譜精確定量的方法相結合,更多地依賴于化學計量學及相關算法模型的開發(fā)應用。

2.5 定性、定量方法

對于2-AP的定性,無論是采用基于GC分離分析還是LC分離分析的檢測方法,絕大多數(shù)情況下均以2-AP在色譜柱上的保留時間定性,即通過樣品中2-AP的保留時間與標準品保留時間的比對,確認是否存在2-AP。在采用質譜作為檢測器時,還可輔以全掃描條件下碎片離子的豐度特征與標準譜庫中2-AP進行匹配或是精確質量數(shù)分析而進行定性。

而對于香米中2-AP的定量,由于基質的影響不容忽視,除采用空白基質加標法進行校正之外,使用最多的還是內標法,常用的非同位素標記內標物主要有2,6-二甲基吡啶(2,6-DMP)、2,4,6-三甲基吡啶(TMP)及2-乙?；量?2-Pyr)等。選擇TMP作為內標主要是因為它與2-AP具有相似的物理化學性質,結構穩(wěn)定,在GC柱上與2-AP的保留時間比較接近。1983年,Buttery等[21]首次利用TMP作為內標,測定了數(shù)十種不同類型香米煮熟后2-AP的含量,其含量為0.006～0.09 mg/kg。之后,TMP作為測定2-AP的內標,被應用于多項研究中。但也有一些研究表明,在采用GC柱分離時,TMP會和樣品中的組分發(fā)生峰重疊的現(xiàn)象,因此,與TMP性質類似的2,6-DMP有時也會被用作2-AP測定的內標物[15],相似地,還有研究人員采用與2-AP性質更為接近的2-Pyr為內標進行定量校正[41]。

由于穩(wěn)定同位素內標法相對于以上內標法而言,在對2-AP進行定量分析時具有更加明顯的優(yōu)勢,近年來已成為香米中2-AP測定時所采用的主要方法。穩(wěn)定同位素內標法是將一定量被測物質的同位素異構體加入試樣中,待其與被測物質均勻混合后,在同一樣品前處理過程中被提取、凈化,并進入相應的儀器,根據(jù)質量數(shù)的微小差異進行定性和內標法校正,從而計算出待測物的含量。2-AP最常用的同位素內標為氘代的2-AP-(CD3)和13C標記的2-AP-(13CH3), Yoshihashi等[50]使用13C標記的2-AP為內標對香米中2-AP的含量進行了校正分析,并用2-AP-(CD3)為內標分析校正了水稻幼苗中的2-AP。Yin等[51]使用13C標記的2-AP作為內標,采用頂空固相微萃取結合GC-MS聯(lián)用的方法,對不同包裝的香米中的2-AP含量做了調查。Hien等[25]則采用13C標記的2-AP作為內標,GC-MS法對亞洲香米中的2-AP含量進行了分析,并和嗅覺測試結果的相關性進行了研究。Maraval等[52]以2-AP-d2(吡咯環(huán)上的5號位2個H被D取代)為內標,結合氣相色譜-正離子化學電離-離子阱質譜(GC-PCI-IT-MS/MS)實現(xiàn)了香米中2-AP的精確測定。在定量分析過程中,當采用GC-MS相關的分析方法對2-AP進行測定時,通常采用SIM法,即采集某一用于定量分析離子的信號(如m/z111、83、68),與內標物的信號進行比值分析,再與2-AP的含量建立定量關系曲線。但有些研究人員為了減少可能的干擾或增強檢測的特異性,采用多個子離子信號總和的方式進行定量[34];而采用HPLC-MS/MS對樣品中的2-AP進行測定時,則充分發(fā)揮多反應監(jiān)測(MRM)的優(yōu)勢,通過對2-AP衍生產物2-APQ及同位素內標2-APQ-d4所產生的多個定性、定量離子的同時監(jiān)測,實現(xiàn)了2-AP的精確測定[48]。在采用穩(wěn)定同位素內標法進行定量分析時,如何保證加入到樣品中的同位素標記的2-AP和樣品中本身含有的2-AP能夠完全從樣品質基中釋放出來也需要引起注意,Cadwallader等[53]通過選擇合適的萃取劑和長達120 min的萃取時間,獲得了最大的萃取效率和滿意的測定結果。

3 結論與展望

2-乙?；?1-吡咯啉作為香米香味成分的生物標志物,因其含量的高低直接影響香米的香味程度并對其價值起到一定的決定性作用,在香米的進出口貿易、香稻的呈香機理、遺傳育種及農業(yè)水肥管理、米香味風味成分的開發(fā)等領域,開展2-AP精準檢測方法的研究,具有重要意義。由于食品樣品基質的復雜性,以及2-AP本身的不穩(wěn)定性和高溫前處理過程中可能會生成的特點,在對樣品中的2-AP進行提取、凈化、富集等前處理時,需要仔細評估前處理過程對最終測定結果的可能影響,目前應用較多的是SPME法和傳統(tǒng)溶劑萃取法,隨著SPME技術的進一步發(fā)展以及能夠有效從稻米樣品中提取2-AP的乙醇溶劑萃取法的開發(fā),新型SPME法和乙醇萃取法將會在未來的檢測中越來越多地被應用;在測定方法的選擇上,氣相色譜法、氣相色譜-嗅覺測定法、電子鼻法等因易受基質干擾、重現(xiàn)性和靈敏度還有待進一步提高等問題,其未來的實際應用將越來越有限,而能夠通過同位素內標稀釋法進行校正的色譜-質譜聯(lián)用分析法特別是LC-MS/MS法應成為精準檢測的首選方法。未來的研究方向要進一步圍繞樣品中2-AP的高效提取前處理方法及精準定量儀器分析方法的開發(fā)展開。