快速濾過型凈化結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)茶葉中10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留

黃云霞, 孟志娟, 趙麗敏, 孫文毅, 王 東, 范素芳, 李 強(qiáng), 張 巖

(河北省食品檢驗(yàn)研究院, 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 石家莊 050000)

茶在中國(guó)有著源遠(yuǎn)流長(zhǎng)的歷史,茶中富含茶多酚、氨基酸、黃酮、茶多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),具有抗氧化、抗癌和抗炎的作用,并且有助于降低患高膽固醇和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),對(duì)人體健康有很大益處[1,2],因而是最受歡迎的飲品之一。許多亞洲國(guó)家,尤其是中國(guó)和日本以其聞名。然而近年來,隨著各國(guó)在食品質(zhì)量安全方面要求越來越高,以及日趨激烈的國(guó)際貿(mào)易競(jìng)爭(zhēng),在茶葉農(nóng)藥殘留限量上,許多茶葉進(jìn)口國(guó)家和地區(qū)(以日本和歐盟為代表)制定了更為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),因而茶葉中農(nóng)藥超標(biāo)問題已成為中國(guó)茶葉出口最重要的技術(shù)貿(mào)易壁壘[3]。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有高效、低毒、低殘留和對(duì)作物安全等特點(diǎn),因而成為茶葉種植中被廣泛使用的一類農(nóng)藥。我國(guó)在國(guó)家監(jiān)督抽檢中也把茶葉樣品中的擬除蟲菊酯農(nóng)藥列為檢測(cè)項(xiàng)目。GB 2763-2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在茶葉中的最大殘留限量(MRL)值做出了規(guī)定[4]。

茶葉中含有大量的茶多酚、嘌呤、生物堿和色素等物質(zhì)[5],具有很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)(ME),而茶葉農(nóng)藥殘留的含量往往很低,嚴(yán)重影響檢測(cè)[6]。因此,對(duì)茶葉樣品進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析,前處理過程中凈化步驟是一個(gè)很重要的影響因素。此外,良好的凈化前處理可以減少分析儀器受污染和損害,延長(zhǎng)儀器壽命。目前,農(nóng)藥殘留檢測(cè)的樣品前處理方法主要有固相萃取法[7-9]、分散固相萃取法[10,11]、加速溶劑萃取法[12,13]、液液萃取法[14,15]和QuEChERS法[16-18]等。但一些傳統(tǒng)的樣品制備方法存在一定缺陷,例如樣品處理時(shí)間長(zhǎng),試劑消耗大,耗材用量多等,因而一種操作簡(jiǎn)便、樣品處理成本低的茶葉農(nóng)藥殘留測(cè)定的前處理方法成為研究人員的開發(fā)目標(biāo)。QuEChERS法是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiades教授于2003年開發(fā)的一種農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)[19]。該技術(shù)因其顯著的樣品前處理優(yōu)點(diǎn),在農(nóng)藥殘留分析中快速應(yīng)用起來,并得到不斷改進(jìn)。快速濾過型凈化法(m-PFC)是一種基于QuEChERS法發(fā)展起來的用以去除基質(zhì)樣品中的共提取物的凈化方法。該方法凈化材料除含有常用的N-丙基乙二胺(PSA)和十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)外,還使用了多壁碳納米管(MWCNTs)。該方法是將凈化填料裝于并固定在注射器中,通過吸取提取液再推送出去的方式,使提取液中的色素、有機(jī)酸、脂肪、糖類等雜質(zhì)與填料層作用,但目標(biāo)物不被吸附,從而實(shí)現(xiàn)凈化。與傳統(tǒng)QuEChERS方法相比,該方法無需稱量吸附劑,提取液不需轉(zhuǎn)移,萃取凈化一步完成,大大縮短了凈化時(shí)間,提高了前處理速率和效率[20]。目前該方法已成功應(yīng)用于水果和蔬菜[21-23]等農(nóng)藥的多殘留檢測(cè)中,但尚未見用于茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的多殘留檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采取m-PFC凈化柱進(jìn)行前處理,選取在茶葉中常用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥為研究對(duì)象,結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù),建立了茶葉中聯(lián)苯菊酯(bifenthrin)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、氯菊酯(permethrin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、氟氰戊菊酯(flucythrinate)、氰戊菊酯(fenvalerate)、氟胺氰菊酯(fluvalinate)、溴氰菊酯(deltamethrin)10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測(cè)的方法,旨在為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)茶葉中的農(nóng)藥多殘留提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

GC-MS-TQ 8050氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、SH-Rxi-5Sil MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(日本島津公司);高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司); VM200旋渦振蕩儀(托摩根生物科技有限公司); 3K15型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L)購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,于4 ℃冰箱保存。乙腈、丙酮和乙酸乙酯(色譜純,德國(guó)Merck公司); QuEChERS凈化管(簡(jiǎn)單基質(zhì))(含有150 mg MgSO4和50 mg PSA)、QuEChERS凈化管(復(fù)雜基質(zhì))(含有150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18和50 mg石墨化炭黑(GCB))(美國(guó)Thermo公司); m-PFC柱,含有120 mg MgSO4、45 mg PSA和45 mg MWCNTs(北京綠綿科技有限公司); Cleanert TPT固相萃取柱(2 000 mg/12 mL)、0.22 μm微孔濾膜(天津艾杰爾公司)。本實(shí)驗(yàn)用50例茶葉樣品均購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

表 1 10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的CAS號(hào)、保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 CAS numbers., retention times (tR) and MS parameters of the 10 pyrethroid pesticides

CE: collision energy.

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

稱取已粉碎好的茶葉樣品2 g(精確至0.001 g),置于50 mL離心管中,用移液管準(zhǔn)確加入10 mL乙腈,擰緊瓶蓋旋渦混勻2 min,以 9 500 r/min 離心3 min。

1.2.2 凈化

(1)QuEChERS：用移液管準(zhǔn)確移取上述提取液2 mL于QuEChERS凈化管中,旋渦振蕩2 min,以 9 500 r/min 離心3 min,上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜,進(jìn)GC-MS/MS分析。

(2)m-PFC：用移液管準(zhǔn)確移取上述提取液2 mL,置于5 mL離心管中,向上緩慢抽動(dòng)m-PFC柱(注射器型)的注射桿,使2 mL提取液全部經(jīng)過填料層,m-PFC柱注射器端連接0.22 μm有機(jī)濾膜,置于進(jìn)樣小瓶上方,然后緩慢推動(dòng)注射桿,即得待測(cè)液,待GC-MS/MS分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

空白基質(zhì)溶液:稱取2 g(精確至0.001 g)空白茶葉樣品,按照1.2.1節(jié)描述進(jìn)行提取,然后將提取液按照1.2.2節(jié)描述進(jìn)行快速濾過型凈化,得相應(yīng)的空白基質(zhì)溶液,將該溶液置于4 ℃冰箱中保存,備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:取10種擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0 mL,配制成10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱保存。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:用空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋,配制質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/L 和0.01 mg/L 的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液;用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制質(zhì)量濃度分別為 0.000 6、0.002、0.003、0.004、0.01、0.05、0.2、0.4和0.8 mg/L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;升溫程序:初始溫度50 ℃,保持1 min,以25 ℃/min 升溫至125 ℃,再以10 ℃/min 升溫至300 ℃,保持15 min;載氣:氦氣(純度≥99.999% ),流速:1.69 mL/min;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣體積:1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:200 ℃;傳輸線溫度:250 ℃;電子能量:70 eV;采用Smart MRM軟件建立10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的三重四極桿質(zhì)譜方法,質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

在農(nóng)藥殘留測(cè)定過程中,可以用于前處理提取的溶劑有很多,考慮待測(cè)農(nóng)藥的極性和溶解程度,本實(shí)驗(yàn)選取乙腈、乙酸乙酯和丙酮作為提取溶劑,選取空白紅茶樣品,按照1.2.1節(jié)步驟提取,采用QuEChERS凈化管(簡(jiǎn)單基質(zhì))凈化。以10種擬除蟲菊酯添加量分別為0.5 mg/kg 時(shí)的回收率和提取液顏色為指標(biāo),綜合考察3種溶劑的提取效果。結(jié)果顯示,乙腈作為提取溶劑時(shí),10種擬除蟲菊酯的回收率均在85%以上,優(yōu)于乙酸乙酯和丙酮。同時(shí),用丙酮提取時(shí),提取液顏色最深,乙腈和乙酸乙酯相對(duì)較淺。綜合考慮,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 提取方式的選擇

QuEChERS法最初用于含水量大于75%的蔬菜和水果中多組分農(nóng)藥殘留的凈化。當(dāng)樣品中含水量少于25%時(shí),需在處理過程中加入水來增加細(xì)胞的通透性,從而提高提取過程中農(nóng)藥殘留的析出。本文考察了空白紅茶樣品中10種擬除蟲菊酯添加水平為0.5 mg/kg 時(shí),茶葉樣品前處理過程中加水和不加水的提取效果。不加水提取過程,按照1.2.1節(jié)進(jìn)行;加水提取,在2 g樣品中先加入10 ml水,浸泡10 min,再加入10 mL乙腈,旋渦振蕩2 min,然后加入氯化鈉6 g,劇烈振蕩1 min,以 9 500 r/min 離心3 min。提取液均按照1.2.2節(jié)采用QuEChERS凈化管(簡(jiǎn)單基質(zhì))凈化。對(duì)兩種提取方式的回收率進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果表明,10種擬除蟲菊酯的回收率分別為88.6% ～115.6%和87.1% ～113.9% ,無顯著性差異。但茶葉樣品加水后,部分水溶性雜質(zhì)溶解出來,造成提取液顏色加深,不利于后續(xù)凈化。因此,綜合考慮回收率和后續(xù)凈化問題,本研究選用不加水浸泡、乙腈直接提取的方法。

2.3 凈化方式的選擇

茶葉中富含茶多酚、脂肪酸、咖啡因和色素等物質(zhì),可以和待測(cè)目標(biāo)物共提取,不僅干擾目標(biāo)物的分離和測(cè)定,而且污染儀器,因而簡(jiǎn)便有效的凈化方式至關(guān)重要。本研究考察了在空白紅茶樣品中添加1.0 mg/kg 目標(biāo)化合物,采用QuEChERS凈化離心管(簡(jiǎn)單基質(zhì))、QuEChERS凈化離心管(復(fù)雜基質(zhì))和m-PFC柱時(shí)茶葉提取液的凈化效果(見圖1)和回收率。采用QuEChERS凈化離心管(簡(jiǎn)單基質(zhì))凈化后茶葉提取液顏色仍然較深,色譜圖中雜峰較多,目標(biāo)化合物回收率為89.2% ～105.5% ;采用QuEChERS凈化離心管(復(fù)雜基質(zhì))凈化后,提取液顏色幾乎無色,色譜圖中雜峰明顯變少,回收率為51.4% ～76.2% ;采用m-PFC柱凈化后,提取液顏色較淺,色譜圖中雜峰相對(duì)較少,回收率為88.0% ～106.2% 。

圖 1 經(jīng)不同凈化方式處理后茶葉(1.0 mg/kg)提取液的照片和總離子流色譜圖Fig. 1 Graph and total ion current chromatograms of the tea extracts (1.0 mg/kg) cleaned up by different purification methods

PSA是一種弱陰離子交換填料,可通過氫鍵萃取極性化合物,從而去除色素、有機(jī)酸、糖類等極性物質(zhì),但吸附能力有限,對(duì)于色素含量高的茶葉樣品,凈化效果并不理想。GCB雖然對(duì)于高色素含量的樣品有強(qiáng)大的凈化能力,但對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的菊酯類農(nóng)藥有很大的吸附問題,易導(dǎo)致回收率較低。而m-PFC凈化柱中的填料層不僅含有PSA,還有多壁碳納米管凈化填料。多壁碳納米管材料是一種納米級(jí)中空材料,具有高比表面積、優(yōu)異的耐酸堿能力和耐熱能力的特性。與PSA相比,多壁碳納米管對(duì)茶葉中雜質(zhì)如色素、有機(jī)酸等吸附容量更大,吸附能力更強(qiáng),而且還能減少對(duì)具有苯并雜環(huán)類結(jié)構(gòu)的菊酯類農(nóng)藥的吸附問題。綜合考慮,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取m-PFC凈化柱凈化,不僅能對(duì)提取液起到良好的凈化效果,而且能保證較高的回收率。

表 2 10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和最大殘留限量Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2), LODs, LOQs and the maximum residue limits (MRL) of the 10 pyrethroid pesticides

y: peak area;x: mass concentration, mg/L; * GB 2763-2019; /: not given.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

農(nóng)藥殘留測(cè)定中,普遍存在基質(zhì)效應(yīng)。茶葉中富含茶多酚,有機(jī)酸和色素等物質(zhì),可以和待測(cè)目標(biāo)物共提取,這些物質(zhì)進(jìn)入色譜柱,在與目標(biāo)物共洗脫時(shí),會(huì)影響目標(biāo)物的離子化效應(yīng)[24],從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。ME=(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的峰面積/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積)×100%[25]。

本實(shí)驗(yàn)配制0.05 mg/L 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和同等濃度的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液,重復(fù)測(cè)定3次,考察10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥在綠茶、烏龍茶、紅茶和普洱茶4種不同類型茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示,10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥在4種茶葉樣品中均呈現(xiàn)不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME在107% ～162%之間。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥在同一種茶葉中基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)存在差異。例如,在普洱茶中,10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)在116% ～162%之間,其中聯(lián)苯菊酯基質(zhì)效應(yīng)最強(qiáng)。此外,10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥在不同類型的茶葉中基質(zhì)效應(yīng)也有一定的差異性。例如,氯菊酯在綠茶、烏龍茶、紅茶和普洱茶中基質(zhì)效應(yīng)分別為123% 、129% 、137%和146% ;溴氰菊酯和氰戊菊酯在紅茶和普洱茶中的基質(zhì)效應(yīng)均大于140% ,而在綠茶和烏龍茶中的基質(zhì)效應(yīng)均小于132% 。這可能是由于不同類型的茶葉在茶多酚、色素、生物堿等含量上的差異造成的?；诓煌愋筒枞~之間基質(zhì)效應(yīng)的差異,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)配制同類型的茶葉基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行定量分析,以此保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

按照1.3節(jié)描述配制質(zhì)量濃度為 0.000 6～0.8 mg/L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,以各個(gè)農(nóng)藥的峰面積為縱坐標(biāo),相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),考察10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的線性關(guān)系。結(jié)果顯示,10種農(nóng)藥在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均>0.998 0;以信噪比(S/N)約為3和10時(shí)的空白樣品添加濃度計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.001～0.015 mg/kg 和0.003～0.050 mg/kg(見表2)。由表2可知,GB 2763-2019對(duì)氟胺氰菊酯在茶葉中的最大殘留量未做規(guī)定,其余9種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的檢出限和定量限遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)中規(guī)定的最大殘留量。因此該實(shí)驗(yàn)方法不僅滿足使用要求,也可為今后國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定氟胺氰菊酯在茶葉中的限量提供依據(jù)。

2.6 回收率與精密度

選取空白紅茶和綠茶樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn),考察定量限、0.05、0.2和2 mg/kg 添加水平下,10種擬除蟲菊酯的回收率和精密度,每個(gè)水平平行測(cè)定6次,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,在不同的添加水平下,方法的平均回收率在87.5% ～111.3%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1% ～8.9% ,表明該方法準(zhǔn)確度較高,精密度良好,能夠滿足檢測(cè)要求。

表 3 10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥在綠茶和紅茶中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the 10 pyrethroid pesticides spiked in the green tea and black tea (n=6)

2.7 與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較

選取空白紅茶樣品,考察農(nóng)藥添加水平1.0 mg/kg ,采用本實(shí)驗(yàn)方法和GB/T 23204-2008方法前處理時(shí)10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率。采用本方法凈化后,方法的回收率為88.6% ～106.1%,采用國(guó)標(biāo)方法中茶葉專用固相萃取柱Cleanert TPT凈化后的回收率為89.5% ～108.7%,兩者回收率無顯著差異。但標(biāo)準(zhǔn)方法凈化步驟過于繁瑣,且洗脫液中含有甲苯,毒性較大。而本實(shí)驗(yàn)采用m-PFC柱,萃取凈化一步完成,試劑用量少,提取液無需濃縮,凈化過程直接吸附雜質(zhì),無需洗脫,單個(gè)樣品前處理時(shí)間小于15 min,該方法在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的前提下大大提升了檢測(cè)效率。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用優(yōu)化后的方法對(duì)市售的10種茶葉(龍井茶、碧螺春、鐵觀音、大紅袍、白毫銀針、白牡丹茶、祁門紅茶、正山小種、普洱茶、安化黑茶)共50例樣品進(jìn)行測(cè)定,其中24個(gè)茶葉樣品檢出擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留,檢出率為48% 。檢出農(nóng)藥種類和頻次為聯(lián)苯菊酯20頻次、氰戊菊酯14頻次、氯氰菊酯6頻次、溴氰菊酯5頻次和氯氟氰菊酯3頻次,其余農(nóng)藥未檢出;同時(shí)檢出農(nóng)藥的殘留量均未超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最大殘留限量值。

3 結(jié)論

本文針對(duì)茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn),采用乙腈直接提取,經(jīng)m-PFC柱凈化,結(jié)合GC-MS/MS,建立了茶葉中10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的快速定性定量分析的方法,并運(yùn)用所建方法檢測(cè)50例茶葉樣品。與傳統(tǒng)樣品預(yù)處理方法相比,該法具有操作簡(jiǎn)單、快速高效、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn),為日常大量茶葉樣品中多種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速篩查檢測(cè)提供了一條新途徑。