經(jīng)典名方甘姜苓術(shù)湯中甘草苷含量的HPLC 測定

劉 鶴，賀丹彤，邢春來，何 蕊，劉 睿，成光宇，位 鴻*

（1.長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117；2 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學創(chuàng)新實踐中心，長春 130117）

甘姜苓術(shù)湯出自《金匱要略·五臟風寒積聚病脈證并治第十一》[1]，并被國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》收錄，全方由甘草、干姜、茯苓、白術(shù)組成，在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、盆腔炎、腎積水等方面具有良好效果[2-5]。甘草苷是甘姜苓術(shù)湯中有效且穩(wěn)定存在的成分，本實驗建立了甘姜苓術(shù)湯中有效成分甘草苷的含量測定方法，并進行方法學驗證[6-9]，為甘姜苓術(shù)湯的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國Waters 公司2695 液相色譜儀，PDA 檢測器；KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；CP225D 型電子天平（德國sartorius 公司）；Labconco Free Zone 冷凍干燥機（美國Labconco 公司）。

1.1.2 藥品與試劑 甘草苷對照品（批號：111610-201607，供含量測定用，規(guī)格：20 mg，購于中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、乙醇為色譜純，水為超純水；其它試劑均為分析純。

1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應性 島津WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相乙腈（C）-0.05%磷酸水溶液，流動相比例0～8 min：19%C；8～45 min：19%～68%C；45～47 min：68%～90% C；47～55 min：90%C；55～60 min：90%～19%C；60～65 min：19% C；檢測波長237 nm；流速1.0 mL/min。進樣量10 μL；甘草苷的理論塔板數(shù)不低于5 000；柱溫為室溫。

1.3 對照品溶液的制備 精密稱取甘草苷對照品，加70%乙醇制成每1 mL 含0.02 mg 溶液，搖勻，即得。

1.4 供試品溶液的制備 按處方量取甘草28.0 g，白術(shù)28.0 g，茯苓56.0 g，干姜56.0 g（共計168.0 g），加1 000 mL 水，浸泡30 min，明火煎煮至沸騰轉(zhuǎn)為文火，煎至得煎液600 mL，冷凍干燥，得提取物粉末備用。

取提取物粉末（過四號篩）約0.1 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加70%乙醇8 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2 方法學驗證

2.1 專屬性考察 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號：Inertsil ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸水為流動相，梯度洗脫；檢測波長為237 nm[10]。

分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液、溶劑各10 mL，注入液相色譜儀，甘草苷分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，色譜圖見圖1、2、3、4。

2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取甘草苷對照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mL，注入液相色譜儀，測定，以進樣量（mg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線[11]?；貧w方程：Y=1 307.6X-2 861.5，r=0.999 7（甘草苷），甘草苷線性范圍為40.02～400.20 mg，試驗結(jié)果見表1、圖5。

圖1 溶劑專屬性考察

圖2 甘草陰性專屬性考察

圖3 甘草苷對照品專屬性考察

圖4 供試品專屬性考察

表1 線性關(guān)系考察

圖5 甘草苷標準曲線

2.3 穩(wěn)定性考察 精密吸取對照品溶液和同一批供試品溶液各10 mL，分別在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h 進樣，依法測定[12]，以甘草苷峰面積積分值為指標，計算甘草苷RSD為0.43%，表明樣品中穩(wěn)定性良好，24 h 內(nèi)測定結(jié)果可靠，結(jié)果見表2。

2.4 精密度考察 精密吸取甘草苷對照品溶液10 mL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6 次，依2.3 項下測定[13]，記錄峰面積積分值，計算得甘草苷對照品溶液連續(xù)測定的RSD 為0.74%，表明儀器、方法的精密度良好，結(jié)果見表3。

表2 甘草苷穩(wěn)定性試驗

表3 甘草苷精密度試驗

2.5 重現(xiàn)性考察 精密稱取同一批樣品共6 份，按2.2供試品溶液項下制備，依法獨立測定[14]，以甘草苷為含量測定指標，計算樣品含量，結(jié)果RSD 為1.08%，平均含量為21.479 6 mg/g，表明該方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表4。

2.6 準確度試驗 取重復性試驗同批樣品，取約0.05 g，共6 份，精密稱定，置10 mL 量瓶中，分別精密加入甘草苷對照品1.001 mg，加入70%乙醇，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液，依法測定[15]，計算平均回收率為99.74%，RSD 為1.60%，表明本法準確性較好，方法可行，結(jié)果見表5。

表4 重現(xiàn)性試驗

表5 回收率試驗結(jié)果

2.7 含量測定 取不同產(chǎn)地不同批次藥材飲片制備15批甘姜苓術(shù)湯提取物粉末，依法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 mL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算15 批甘姜苓術(shù)湯提取物粉末中甘草苷含量[16]，結(jié)果見表6。

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗考察對比了不同的流動相系統(tǒng)[17]，包括乙腈—水、乙腈-0.05% 磷酸水溶液；結(jié)果表明，以乙腈-0.05% 磷酸水溶液體系為流動相，采用梯度洗脫，能夠達到較好的洗脫效果，各色譜峰的峰形和分離度相對較好，故選用乙腈-0.05% 磷酸水溶液作為流動相系統(tǒng)。

表6 測定結(jié)果

3.2 檢測波長的選擇 精密吸取甘草苷對照品溶液10 mL，進樣分析，利用 PDA 檢測器進行全波長掃描[18]，測得最大吸收為237 nm，與2015版《中國藥典》“甘草”項下收載的檢測波長為237 nm 相符，因此選擇237 nm為檢測波長[19-20]。

3.3 結(jié)論 該方法建立了應用高效液相色譜法測定甘姜苓術(shù)湯中甘草苷含量的方法，該方法專屬性好，精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合方法學驗證要求，可以作為甘姜苓術(shù)湯質(zhì)量控制方法。