滋益顆粒的工藝研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

張春婷，邱智東，李博文，鄒 睿，劉欣蔚，董雪蓮

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

滋益顆粒為長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，該方由生地黃[1-3]、牡丹皮、浙貝母、北沙參、金蕎麥、丹參、佛手、黃芪等8 味中藥經(jīng)現(xiàn)代工藝提取制成的一種復(fù)方制劑，具有增強免疫力的功效。本研究通過正交實驗對提取工藝進行優(yōu)化，對輔料及粘合劑進行單因素考察，參考2015 版《中華人民共和國藥典》方法對處方中的部分中藥進行定性鑒別，為今后的進一步研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試藥 滋益顆粒（批號：20192001、20192002、20192003、20192004、20192005、20192006、20192007、20192008、20192009、20192010）；黃芪甲苷對照品（批號：110781-201616）、黃芪對照藥材（批號：Y19D8H51060）、佛手對照藥材（批號：Y12A9H58681）、丹參酮Ⅱa 對照品（批號：110766-201721）、丹酚酸B 對照品（批號：111562-201716）、丹參對照藥材（批號：120923-201615）、地黃對照藥材（批號：121180-201506)、牡丹皮對照藥材（批號：121490-201603）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201713）。實驗中用到的固體試劑為化學(xué)純，所用到的液體試劑除色譜甲醇及乙腈外均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備 AgiLent1260 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）；ZF-2 型紫外儀，上海安亭；MS105DU型十萬分之一天平；TG328A 型分析天平；HHS 型恒溫水浴鍋，江蘇常熟；DZF-6090 型真空干燥箱，上海一恒。

2 方法及結(jié)果

2.1 提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 正交實驗設(shè)計 選定煎煮時間、煎煮次數(shù)和加水量3 因素，每個因素取3 個水平。按L9（34）正交試驗表進行正交試驗[4-5]，確定最優(yōu)提取工藝，水煎煮因素水平表見表1，水煎煮法提取工藝正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 水煎煮因素水平表

表2 水煎煮法提取工藝正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

2.1.2 優(yōu)選提取工藝 根據(jù)直觀分析和方差分析結(jié)果，A 因素水平變化對試驗結(jié)果影響較小，B 和C 因素水平變化對試驗結(jié)果有顯著影響，確定水煎煮法提取最佳工藝是A1B2C2，即水煎藥材加即8 倍量水，提取2次，每次1 h。

2.1.3 優(yōu)選提取工藝的驗證試驗 按處方2 倍量比例稱取藥材，按優(yōu)選的最佳水煎煮工藝條件提取，重復(fù)驗證3 次，測定驗證樣品中平均總毛蕊花糖苷含量為45.38 mg，RSD=1.13 %，說明重現(xiàn)性良好，確定優(yōu)選出的工藝條件為最佳工藝，見表4。

2.2 成型工藝優(yōu)選

2.2.1 輔料的選擇 單因素考察淀粉、糊精、乳糖3種輔料[6-9]。糊精成型性好、價格低廉，選擇糊精作為輔料，見表5。

2.2.2 潤濕劑的選擇 對乙醇進行考察，乙醇濃度為75%時，顆粒軟材的軟硬度適宜，選擇75 %乙醇作為潤濕劑，見表6。

2.3 滋益顆粒的定性鑒別

2.3.1 黃芪 TLC 鑒別 參考2015 版《中國藥典》一部黃芪顆粒項下的薄層色譜鑒別方法[10-11]，取10 g 滋益顆粒精細(xì)研磨并放入錐形瓶中，加入25 mL 蒸餾水，超聲0.5 h，過濾，濾液用飽和正丁醇提取2 次，每次25 mL。合并提取液，濃氨水洗滌2 次，每次30 mL，蒸發(fā)正丁醇。殘渣加正丁醇1 mL，得供試品溶液。取黃芪對照藥材1 g，煮0.5 h，冷卻、過濾，同法制備對照藥材溶液。取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇得2 mg·mL-1對照品溶液。相同工藝制備缺黃芪的滋益顆粒，取10 g同法制成陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL 于同一硅膠G 薄層板。用氯仿—甲醇—水（13:7:2）的下層溶液為展開劑，展開、取出吹干，噴10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點清晰。供試品色譜中，相同顏色斑點與對照藥材色譜、對照品色譜相同位置顯出；無陰性干擾，見圖1。

表4 工藝驗證實驗結(jié)果

表5 輔料的考察結(jié)果

表6 潤濕劑的考察結(jié)果

2.3.2 佛手 TLC 鑒別 參考2015 版《中國藥典》一部佛手項下的薄層色譜鑒別方法[10]。取出5 g 滋益顆粒并精細(xì)研磨，加無水乙醇10 mL，超聲20 min，過濾，濾液蒸干。殘渣加0.5 mL 無水乙醇，為供試品溶液。取佛手對照藥材1g，同法制備對照藥材溶液。相同工藝制備缺佛手滋益顆粒，取5 g 同法得陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL 于同一硅膠G 薄層板。用展開劑環(huán)己烷—乙酸乙酯（3:1）展開，取出干燥，置365 nm 紫外光下檢視。供試品色譜中，相同顏色的熒光斑點與對照藥材色譜對應(yīng)位置上顯示；無陰性干擾，見圖2。

圖1 黃芪薄層色譜鑒別圖

圖2 佛手薄層色譜鑒別圖

2.3.3 丹參TLC 鑒別 參照2015 版《中國藥典》一部丹參項下的薄層色譜鑒別方法[10]。取滋益顆粒1 g，研磨成粉末，加乙醇5 mL，超聲15 min，離心，取上清液作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA 對照品、丹酚酸B對照品，加乙醇制成0.5 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷—甲苯—乙酸乙酯—甲醇—甲酸（6:4:8:1:4）為展開劑，展開，展至約4 cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）—乙酸乙酯（4:1）為展開劑，展開，展至約8 cm，取出，晾干，分別在日光及紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點或熒光斑點，見圖3。

圖3 丹參薄層色譜鑒別圖

2.3.4 地黃TLC 鑒別 取滋益顆粒21 g 研磨成細(xì)粉，加入25 mL 環(huán)己烷，將混合物在室溫（25 ℃）超聲2 h，放置12 h。過濾，棄去濾液，濾渣風(fēng)干。加25 mL 乙酸乙酯，并在室溫（25 ℃）條件下超聲1 h 提取充分。取出后過濾，置于蒸發(fā)皿中濃縮濾液，并蒸發(fā)至干，用1 mL 氯仿溶解后，得到對照藥材溶液。取1 g 生地黃對照藥材，并使用以上方法制備供試品溶液。相同工藝制備缺生地黃的滋益顆粒，取21 g 同法得陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL 于同一硅膠G薄層板，用展開劑正己烷—丙酮—乙酸乙酯（10:2:1）展開。取出干燥，噴5%硫酸香草醛乙醇溶液，105 ℃烘至斑點清晰[12-13]。供試品色譜中，相同顏色斑點在與對照藥材色譜相應(yīng)位置顯出，陰性無干擾，見圖4。

2.3.5 牡丹皮TLC 鑒別 取滋益顆粒25 g，加乙醚25 mL，超聲0.3 h，過濾，蒸干濾液。加1 mL 丙酮，得供試品溶液。取牡丹皮對照藥材1 g，同法制備對照藥材溶液。相同工藝制備缺牡丹皮滋益顆粒，稱取10 g 同法得陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL于同一硅膠G 薄層板，用展開劑環(huán)己烷—乙酸乙酯（3:1）展開，取出吹干，噴鹽酸酸性5%三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點清晰。供試品色譜中相同顏色的斑點在與對照藥材色譜相應(yīng)位置顯示[14-15]，無陰性。見圖5。

圖4 地黃薄層色譜鑒別圖

圖5 牡丹皮薄層色譜鑒別圖

3 小結(jié)

滋益顆粒是具有免疫調(diào)節(jié)功能[22-23]，解決癌癥患者免疫力低下問題，對免疫力低下患者的康復(fù)具有重大意義。本實驗通過正交實驗，優(yōu)化滋益顆粒提取工藝，通過TLC 法對黃芪、佛手、丹參、地黃、牡丹皮5 味中藥進行定性鑒別，專屬性強，重新性較好，初步建立該顆粒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)試驗研究提供參考。