家族性皮質(zhì)肌陣攣震顫性癲癇CTNND2基因的檢測(cè)

劉彩霞， 孫 維， 田智敏， 陳秋惠， 史寶和， 孫亞娟， 李 佳

家族性皮質(zhì)肌陣攣震顫性癲癇(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，F(xiàn)CMTE)又稱良性成人家族性肌陣攣性癲癇(Benigh adult familial myoclonic epilepsy，BAFME)，是一種罕見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)常染色體顯性遺傳疾病。盡管研究者已做了大量研究，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前在我國(guó)、日本、意大利、法國(guó)等多個(gè)國(guó)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2p11-q12.2、10p15、8q23.3-24.1、5p15.31-p15、3q26.32-3q28等5個(gè)致病基因位點(diǎn)，我國(guó)報(bào)道的病例的致病基因位點(diǎn)主要位于5p15.31-p15和10p15，但目前尚未克隆出該病的致病基因。課題組在前期工作中通過(guò)連鎖分析，將致病基因位點(diǎn)定位在5號(hào)染色體的某一區(qū)段[1]，經(jīng)過(guò)對(duì)該區(qū)段相關(guān)基因的功能分析，預(yù)測(cè)CTNND2可能為該FCMTE家系的致病基因，因此本研究對(duì)該家系中7例患者進(jìn)行CTNND2篩查，以明確該基因是否為該家系的致病基因。本文將對(duì)其檢測(cè)結(jié)果做一報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 對(duì)確診的家族性皮質(zhì)肌陣攣震顫性癲癇一家系包括先證者在內(nèi)的7例發(fā)病者進(jìn)行基因突變分析。此家系8例患者均成年發(fā)病，男女患病機(jī)會(huì)均等，除第Ⅳ代一人為可疑患病外，其余三代均有發(fā)病。發(fā)病成員無(wú)發(fā)育遲滯，多以震顫為首發(fā)癥狀，伴有癲癇發(fā)作、頭痛等癥狀，癲癇主要表現(xiàn)為強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，多伴有焦慮癥狀，智能受損不明顯?？诜匚縻?、苯巴比妥、卡馬西平等藥物癲癇治療有效，但口服β受體阻滯劑或飲酒震顫控制不明顯。病情發(fā)展緩慢，無(wú)明顯進(jìn)展過(guò)程。符合2005年Van Rootselaar提出的“家族皮質(zhì)震顫性肌陣攣性癲癇”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，家系圖見(jiàn)圖1。

圖1 家族性皮質(zhì)肌陣攣震顫性癲癇家系

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 提取獲得受試者知情同意后，取其外周肘靜脈血各5 ml，利用血液基因組DNA提取試劑盒(天根)提取各樣本基因組DNA。

1.2.2 PCR檢測(cè) 建立PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行 PCR產(chǎn)物電泳分析，割膠回收PCR產(chǎn)物并進(jìn)行純化。

1.2.3 基因突變檢測(cè) 用于擴(kuò)增的CTNND2基因編碼區(qū)包括22個(gè)外顯子的引物22對(duì)，根據(jù)CTNND2的gDNA序列，采用Primer3在線設(shè)計(jì)(由上海生物工程公司合成)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將GenBank人類CTNND2基因的gDNA序列與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。CTNND2基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增CTNND2基因的引物

2 結(jié) 果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果CTNND2基因檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2。

2.2 CTNND2基因突變檢測(cè) 利用直接測(cè)序法對(duì)CTNND2基因進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示除先證者CTNND2-18號(hào)外顯子序列只有F-前10bp判讀不清外，其余患者該基因均未見(jiàn)突變(見(jiàn)圖3)。

圖2 先證者CTNND2 PCR檢測(cè)結(jié)果圖

圖3 先證者CTNND2-18號(hào)外顯子序列檢測(cè)峰圖(只有F-前10bp判讀不清，其余未見(jiàn)突變)

3 討 論

家族性皮質(zhì)肌陣攣震顫性癲癇(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，F(xiàn)CMTE)是一種罕見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)常染色體顯性遺傳疾病。成年期發(fā)病，主要表現(xiàn)為四肢細(xì)微震顫或肌陣攣，以遠(yuǎn)端為著，伴或不伴癲癇發(fā)作，情緒緊張、光刺激或睡眠剝奪時(shí)易被誘發(fā)，抗癲癇藥物可有效控制癲癇發(fā)作，而飲酒或使用β受體阻滯劑治療無(wú)效，病程為非進(jìn)展性。軀體誘發(fā)電位顯示肌陣攣或震顫來(lái)源于大腦皮質(zhì)。我們?cè)谂R床工作中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)FCMTE大家系，已對(duì)其臨床特點(diǎn)做了報(bào)道[3]。

目前，在我國(guó)、日本、意大利、法國(guó)等多個(gè)國(guó)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2p11-q12.2、10p15、8q23.3-24.1、5p15.31-p15、3q26.32-3q28等5個(gè)致病基因位點(diǎn)，該病的致病基因至今仍不明確，我國(guó)報(bào)道的病例的致病基因位點(diǎn)主要位于5p15.31-p15和10p15[4～7]。課題組在前期工作中通過(guò)對(duì)家系成員進(jìn)行連鎖分析，將致病基因位點(diǎn)定位在5p15.31-p15[1]，為進(jìn)一步明確該家系致病基因，采用功能候選克隆的策略對(duì)候選基因進(jìn)行篩查。通過(guò)在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中的Human Genome Browser中查詢?cè)?p15.31-p15之間的基因。根據(jù)癲癇的病理生理機(jī)制、已克隆的特發(fā)性癲癇致病基因特點(diǎn)，結(jié)合各個(gè)基因在該候選區(qū)域的表達(dá)及其生物學(xué)特性對(duì)候選基因進(jìn)行選擇，而后將致病基因鎖定為CTNND2。

CTNND2 基因位于5 p15.2染色體上，是2p12 CTNNA2基因的旁系同源基因，編碼連環(huán)蛋白(鈣粘聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白)，它是連環(huán)蛋白家族中的一種，可能參與了神經(jīng)細(xì)胞黏附。該基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜中的表達(dá)更豐富，在大腦功能中扮演重要角色，包括突觸的監(jiān)管[8，9]。

本實(shí)驗(yàn)我們利用PCR產(chǎn)物測(cè)序方法對(duì)受試者CTNND2基因編碼區(qū)包括22個(gè)外顯子進(jìn)行篩選。盡管此次外顯子篩查的結(jié)果為陰性，但仍不能完全排除該基因?yàn)橹虏』?。由于我們主要進(jìn)行的是外顯子測(cè)序，并且以編碼區(qū)為主，未涉及非編碼區(qū)，而非編碼區(qū)的順式作用對(duì)于基因的時(shí)空表達(dá)起關(guān)鍵作用，順式作用元件的突變可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。其次，除了基因本身的調(diào)控元件通過(guò)影響基因的表達(dá)水平導(dǎo)致疾病發(fā)生外，還存在修飾基因異常或修飾基因與基因間相互作用導(dǎo)致疾病發(fā)生的可能。另外，也不能除外嵌合突變的可能。但目前我們尚不考慮該基因?yàn)樵摷蚁抵虏』?，通過(guò)對(duì)該基因的篩查，雖暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，但是能夠幫助我們縮小了篩選范圍。接下來(lái)，課題組將對(duì)候選區(qū)域的其他可疑致病基因進(jìn)行篩查，必要的時(shí)候?qū)蚁党蓡T進(jìn)行全外顯子測(cè)序以尋找致病基因。