親環(huán)素A及腦梗死相關(guān)血液指標(biāo)與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和穩(wěn)定性及腦梗死的相關(guān)性研究

趙悅杉， 郭若一， 顧天舒， 王世佳， 于 萍， 郭 力， 李 彬

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是臨床中最常見引起腦卒中的病因，有研究表明不穩(wěn)定斑塊不可預(yù)測地脫落和破裂是缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1，2]。

研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展與氧化應(yīng)激、炎癥因子造成的炎細(xì)胞浸潤、內(nèi)皮損傷等密切相關(guān)[3]。其中CyPA作為一個(gè)近年來新型的炎癥標(biāo)志物，被證明與斑塊的不穩(wěn)定性相關(guān)[4]。CyPA是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白，為免疫抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)的作用靶點(diǎn)，近些年又因其與動(dòng)脈粥樣硬化的密切關(guān)系而被關(guān)注。CyPA作為過度氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，是炎癥瀑布較為上游的因子，其通過導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、趨化炎癥細(xì)胞加重局部炎癥反應(yīng)、CyPA-CD147-MMP(NF-κB)等途徑參與斑塊的形成且與斑塊穩(wěn)定性相關(guān)。國內(nèi)外的動(dòng)物試驗(yàn)均提示CyPA與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)，但目前尚缺少臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)此點(diǎn)。

臨床中常見的血液指標(biāo)，如總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、糖化血紅蛋白、纖維蛋白等在國內(nèi)外文獻(xiàn)中與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的關(guān)系呈現(xiàn)出不一致性，在本文中進(jìn)行進(jìn)一步研究探討。

彩色多普勒超聲是臨床中發(fā)現(xiàn)、評估頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的常用手段，但由于頸動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性并沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)的判定方法，所以各研究對于彩色多普勒下動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性所用的判斷方法不一，多數(shù)簡單以超聲下斑塊的密度、大小作出人為判斷，本文將以頸動(dòng)脈多普勒下動(dòng)脈斑塊的形態(tài)、密度、長度、厚度等嚴(yán)格分級(jí)做出客觀評分來評價(jià)斑塊的穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步探討頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性與缺血性卒中發(fā)生的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2017年12月～2018年12月期間于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的住院治療的急性腦梗死且存在與腦梗死部位位于同側(cè)的頸動(dòng)脈斑塊的患者56例為腦梗死組，無急性腦梗死但存在頸動(dòng)脈斑塊的人72例為斑塊組，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的且無急性腦梗死的健康體檢者40例為無斑塊組。腦梗死組還要求符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：所有腦梗死患者均符合2012年缺血性腦卒中診斷和診療質(zhì)量控制行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，且發(fā)病時(shí)間不超過3 d；腦梗死類型符合TOAST分型中的 LAA 型；急性梗死灶位于前循環(huán)供血區(qū)且與頸動(dòng)脈斑塊位于同側(cè)；急性梗死灶及頸動(dòng)脈斑塊的對應(yīng)側(cè)無嚴(yán)重顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄。各組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性冠狀動(dòng)脈綜合征、心力衰竭、各種嚴(yán)重的先天性心臟??；(2)自身免疫性疾病及其它炎癥性疾病；(3)惡性腫瘤、合并嚴(yán)重肝腎功能損害等疾?。?4)6 m內(nèi)既往腦血管病病史；(5)合并腦出血、腦血管畸形、顱內(nèi)靜脈竇血栓等顱腦疾病者；(6)患各類急慢性感染性疾??；所有入選患者及健康體檢者均由其本人或監(jiān)護(hù)者簽署知情同意書，并提供血樣，過程符合醫(yī)學(xué)倫理及人道主義要求。

1.2 方法

1.2.1 血液指標(biāo)測定 住院患者于入院次日晨抽取空腹靜脈血標(biāo)本，健康對照者于體檢當(dāng)日抽取空腹靜脈血標(biāo)本，所得標(biāo)本一部分進(jìn)行血常規(guī)、生化全項(xiàng)及凝血常規(guī)檢查，另一部分放入促凝管內(nèi)，充分混合均勻，于標(biāo)本采集30 min內(nèi)在2～8 ℃環(huán)境下以3000 r/min離心15 min，留取血清，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。?yīng)用ELISA測定CyPA值(試劑盒來自上海江萊生物有限公司)，嚴(yán)格按照說明說進(jìn)行操作。

1.2.2 頸動(dòng)脈超聲檢查

1.2.2.1 檢查方法及圖像數(shù)據(jù)處理 采用西門子ACUSON超聲儀，探頭中心頻率為10 MHz。

1.2.2.2 超聲結(jié)果的判讀及斑塊評分 頸動(dòng)脈斑塊診斷標(biāo)準(zhǔn)：檢測雙側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，并于頸動(dòng)脈分叉處近心端1 cm處后壁放大后測量頸總動(dòng)脈內(nèi)膜-中層厚度(Intima-media Thickness，IMT)，IMT>1.5 mm定義為斑塊形成[5]。

斑塊的測量：橫斷面、縱斷面綜合判斷，觀測記錄斑塊的數(shù)量，長度和厚度，多角度觀察斑塊的質(zhì)地和形狀。

斑塊評分：斑塊的均質(zhì)性(回聲一致性)：均質(zhì)斑塊記0分，不均質(zhì)斑塊記1分；斑塊的厚度 厚度小于2 mm記0分，厚度在2～3 mm之間記1分，厚度大于3 mm記2分；斑塊的長度小于15 mm記0分，大于15 mm記1分；若斑塊造成了管腔狹窄，狹窄程度50%～69%記3分，70%～99%及4分(與斑塊厚度不重復(fù)記分)；斑塊的形態(tài)：斑塊表面纖維帽中斷、斑塊表面可看見血栓形成，斑塊表面存在較大凹陷記3分。形態(tài)規(guī)則記0分。最終取同側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈的所有可測量斑塊記分之和為最終單側(cè)頸動(dòng)脈斑塊的評分。腦梗死組記錄與急性梗死灶對應(yīng)側(cè)的頸動(dòng)脈評分，斑塊組記錄雙側(cè)頸動(dòng)脈評分[6，7]。

2 結(jié) 果

2.1 三組基礎(chǔ)資料比較 經(jīng)比較，三組之間在性別、年齡、冠心病、飲酒方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但在高血壓、糖尿病、吸煙史方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見表1)。

2.2 無斑塊組與斑塊組CyPA和相關(guān)血液指標(biāo)的比較 斑塊組CyPA明顯高于無斑塊組，且兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)，說明CyPA與斑塊的形成相關(guān)。Logistic回歸表明CyPA是頸動(dòng)脈斑塊形成的危險(xiǎn)因素(OR=1.002，95%CI0.824～1.219)。其余指標(biāo)兩組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表2)。

2.3 腦梗死組與斑塊組斑塊評分的比較 將腦梗死組的病灶對應(yīng)側(cè)的頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈的斑塊評分與斑塊組雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈的斑塊評分進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦梗死組的斑塊評分顯著高于斑塊組的斑塊評分，且兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，兩組的斑塊評分均值分別為(2.94±3.63)、(0.95±1.32)。說明頸動(dòng)脈斑塊的不穩(wěn)定性與腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)(見表3)。

2.4 腦梗死組內(nèi)CyPA及相關(guān)血液指標(biāo)與頸動(dòng)脈斑塊評分的比較 收集腦梗死病灶同側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈的斑塊評分，與CyPA及相關(guān)血液指標(biāo)進(jìn)行比較。其中糖化血紅蛋白(P=0.019，相關(guān)系數(shù)為0.359)、纖維蛋白原(P=0.041，相關(guān)系數(shù)為0.296)、血紅蛋白(P=0.033，相關(guān)系數(shù)為-0.289)與頸動(dòng)脈斑塊評分之間存在相關(guān)性。經(jīng)Logistics回歸后，纖維蛋白原是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=8.988，95%CI3.017～3.422)。血紅蛋白是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的保護(hù)因素(OR=0.936，95%CI134.031～144.583)。余指標(biāo)與頸動(dòng)脈斑塊評分之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性(P>0.05)(見表4)。

2.5 斑塊組內(nèi)CyPA及相關(guān)血液指標(biāo)與頸動(dòng)脈斑塊評分的比較 將斑塊組患者雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈斑塊的斑塊總分與血CyPA及相關(guān)血液指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中高密度脂蛋白與斑塊總分存在相關(guān)性(P=0.014，相關(guān)系數(shù)為-0.300)，經(jīng)Logistic回歸分析后，高密度脂蛋白是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的保護(hù)因素(OR=0.052，95%CI1.237～1.364)。余指標(biāo)與斑塊評分之間的比較均未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性(見表5)。

表1 3組之間基礎(chǔ)臨床資料的比較[n(%)]

注：兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05

表2 斑塊組與無斑塊組CyPA與相關(guān)血液指標(biāo)的比較

注：兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05

表3 腦梗死組與斑塊組頸動(dòng)脈斑塊評分比較

注：兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05

表4 腦梗死組內(nèi)頸動(dòng)脈斑塊評分與CyPA及相關(guān)血液指標(biāo)比較

注：兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05

表5 斑塊組內(nèi)頸動(dòng)脈斑塊評分與CyPA及相關(guān)血液指標(biāo)比較

注：兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05

3 討 論

國內(nèi)外普遍認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎性疾病，是多種炎癥因子的作用下血管內(nèi)皮的一種慢性炎癥[8～10]，它是各種氧化應(yīng)激因素如高血壓、高血糖、高血脂等的復(fù)雜作用的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)意在探究在健康人群(無腦梗死)中和腦梗死人群中CyPA與頸動(dòng)脈斑塊的形成和穩(wěn)定性的關(guān)系。關(guān)于為何將腦梗死人群和非腦梗死人群分開研究，是由于腦梗死本身存在的局部炎癥反應(yīng)會(huì)影響CyPA等炎性因子的含量。本文通過無斑塊組(無斑塊、無梗死)與斑塊組(無腦梗死，僅有斑塊)的比較來反應(yīng)CyPA與斑塊形成的關(guān)系，結(jié)果顯示兩組之間的CyPA水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，反應(yīng)了CyPA與斑塊的形成相關(guān)，可能的機(jī)制為在各種氧化應(yīng)激的刺激下，CyPA通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及凋亡導(dǎo)致內(nèi)膜屏障受損，且趨化和聚集巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在血管局部吞噬脂質(zhì)，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。本文通過腦梗死組及斑塊組的組內(nèi)斑塊評分的比較來探究CyPA與頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，結(jié)果表明無論是腦梗死組還是斑塊組CyPA與頸動(dòng)脈斑塊評分無明確的相關(guān)性，對于此點(diǎn)與部分文獻(xiàn)的結(jié)果不一致，我們認(rèn)為這一結(jié)果：(1)在斑塊組中患者均來自于體檢中心，總體來說斑塊的評分較低(普遍較為穩(wěn)定)，大多數(shù)在3分以內(nèi)，這樣情況下斑塊穩(wěn)定性差異較小，可能CyPA的差異未顯現(xiàn)出來；(2)在腦梗死組中由于每個(gè)患者的梗死面積不同，局部產(chǎn)生的炎性因子也不同，可能對我們的測量帶來誤差；(3)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不同，臨床試驗(yàn)并不能將斑塊取出進(jìn)行斑塊內(nèi)檢測，我們檢測的因子均為血液循環(huán)中的因子，受全身斑塊的影響，我們只進(jìn)行了頸動(dòng)脈斑塊的評分，對于身體中其余斑塊并未評分，可能也成為了陰性結(jié)果的原因；(4)另外對于斑塊穩(wěn)定性的評價(jià)方法，每個(gè)實(shí)驗(yàn)不盡相同，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)判斷斑塊的穩(wěn)定性主觀性較強(qiáng)，且只能針對單個(gè)斑塊來判斷，對于一根血管的整體狀態(tài)反應(yīng)欠佳，而本實(shí)驗(yàn)確定了一個(gè)相對客觀的評分，可以將每個(gè)斑塊評分相加來反應(yīng)該血管的斑塊狀態(tài)，可能也是實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的原因。

本文通過比較斑塊組和腦梗死組的斑塊評分來探究腦梗死與斑塊不穩(wěn)定性之間的關(guān)系。為了使斑塊與腦梗死之間的關(guān)系更有說服力，在腦梗死組我們僅計(jì)算了與腦梗死病灶對應(yīng)側(cè)的斑塊總評分，與非腦梗死的的雙側(cè)頸動(dòng)脈評分總分進(jìn)行比較，在此種情況下兩組的斑塊評分仍表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這也就表明了斑塊的不穩(wěn)定性與腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)，不穩(wěn)定斑塊的脫落與破裂可能導(dǎo)致了腦梗死的發(fā)生，另外不穩(wěn)定斑塊可以導(dǎo)致血小板的聚集導(dǎo)致局部官腔狹窄，從而造成血流動(dòng)力學(xué)改變而引發(fā)腦梗死。

在腦梗死組中，我們發(fā)現(xiàn)糖化血紅蛋白與頸動(dòng)脈斑塊評分之間存在明確的關(guān)系，與斑塊的穩(wěn)定性成負(fù)相關(guān)(斑塊組由于數(shù)據(jù)缺失未分析)。高血糖是缺血性腦血管病尤其是腦梗死的危險(xiǎn)因素這一點(diǎn)已經(jīng)被絕大多數(shù)研究者認(rèn)可，其大致機(jī)制為：(1)高濃度的血糖使機(jī)體氧化應(yīng)激加強(qiáng)，此過程中產(chǎn)生大量的活性氧，促進(jìn)脂氧化終末產(chǎn)物的生成及蓄積導(dǎo)致炎性因子如超敏C反應(yīng)蛋白等的分泌及血管內(nèi)皮的功能紊亂[11]；(2)糖尿病還會(huì)造成微血管、大血管病變，引起平滑肌細(xì)胞及纖維細(xì)胞增生、結(jié)構(gòu)重塑，這些細(xì)胞攝取脂質(zhì)的同時(shí)也造成內(nèi)膜損傷而與斑塊形成有關(guān)。纖維蛋白原與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)呈負(fù)相關(guān)(斑塊組由于數(shù)據(jù)缺失未分析)?，F(xiàn)在較多研究表明[12]纖維蛋白原與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生、發(fā)展等方面相關(guān)，免疫組化研究表明纖維蛋白原在穩(wěn)定、不穩(wěn)定斑塊中都是重要的組成成分，但在不穩(wěn)定斑塊中的含量顯著增加[13]。有些臨床研究表明纖維蛋白原與斑塊的形態(tài)和進(jìn)展相關(guān)，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的患者中尤其是急性冠脈綜合征的患者中纖維蛋白原與冠狀動(dòng)脈斑塊的斑塊負(fù)荷(包括斑塊面積、斑塊體積)等呈正相關(guān)。Corban MT[14]認(rèn)為纖維蛋白原是斑塊內(nèi)大脂質(zhì)核心的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)提示這種關(guān)系可能同樣適用與頸動(dòng)脈斑塊。纖維蛋白原可以激活幾條促炎通路，這些通路會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞[15]、血管平滑肌細(xì)胞[16]、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞[17]功能障礙；另外，纖維蛋白原還可以通過增加血液黏稠度，刺激血小板的聚集[18，19]，通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)-F肌動(dòng)蛋白途徑損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等對動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起作用。

腦梗死組的患者中血紅蛋白的含量與斑塊的穩(wěn)定性呈正相關(guān)。對于此點(diǎn)，尚缺乏此類研究。血紅蛋白存在于紅細(xì)胞內(nèi)，它的變化及原理應(yīng)與HCT相似。有研究認(rèn)為[20]紅細(xì)胞比容：紅細(xì)胞占全血容積的百分比(HCT)在冠心病的患者中比非冠心病患者中明顯降低，國外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈斑塊形成的患者比無斑塊的患者HCT含量顯著降低。但Gotoh等認(rèn)為無論是高水平還是低水平的HCT與都與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病有關(guān)，但是對于不同亞型的冠心病影響不同[21]。其中的原理還暫不清楚，可能是由于腦梗死人群和冠心病人群中氧化應(yīng)激水平較高導(dǎo)致了血紅蛋白的破壞，而紅細(xì)胞破壞后釋放與氧化應(yīng)激相關(guān)的酶，加重了氧化應(yīng)激陷入了惡性循環(huán)[22]。在本實(shí)驗(yàn)中血紅蛋白與斑塊評分的顯著差異只出現(xiàn)在腦梗死組，在斑塊組中并沒有體現(xiàn)，可能存在以下幾點(diǎn)原因：(1)急性腦梗死患者可以出現(xiàn)嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，加重其對紅細(xì)胞的破壞；另外嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)可能對骨髓的造血有一定影響。(2)急性腦梗死患者通常會(huì)由于食欲較差或吞咽功能異常導(dǎo)致一定的營養(yǎng)障礙，也可能造成結(jié)果的不同。在非梗死組中高密度脂蛋白與斑塊的穩(wěn)定性成正相關(guān)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為高密度脂蛋白是一種保護(hù)性蛋白。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是炎癥反應(yīng)或脂質(zhì)代謝異常介導(dǎo)的大量脂質(zhì)在血管壁內(nèi)的異常聚集，所以高密度脂蛋白對膽固醇的反向運(yùn)輸(從外周的單核巨噬細(xì)胞中運(yùn)回到肝臟，再通過膽汁排泄)對動(dòng)脈粥樣硬化的形成以及斑塊的不穩(wěn)定性有阻斷意義。有些研究還認(rèn)為高密度脂蛋白還可以通過其抗氧化、抗炎、抗血栓對動(dòng)脈粥樣硬化起保護(hù)作用。但近些年高密度脂蛋白對動(dòng)脈粥樣硬化的作用，以及其相關(guān)疾病的發(fā)病率的關(guān)系開始出現(xiàn)爭議。爭議問題主要為以下幾點(diǎn)：(1)有學(xué)者認(rèn)為高密度脂蛋白對心腦血管疾病的保護(hù)作用不在于其血液濃度，而在于其功能強(qiáng)弱，故其存在一定的個(gè)體及人種差異。Favari[23]認(rèn)為臨床中測量血清膽固醇的排泄率比測量血清高密度脂蛋白的濃度對腦血管、心血管等動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性疾病的預(yù)測與復(fù)發(fā)更有意義。在對上述疾病的治療方面，我們更不應(yīng)該僅僅以增加血液中高密度脂蛋白的濃度為切入點(diǎn)，而應(yīng)以增加血清膽固醇排泄率為標(biāo)準(zhǔn)。(2)Eduard[24]的研究表明不同亞型的高密度脂蛋白對頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用不一致。高密度脂蛋白主要有2個(gè)亞型，分別為HDL2-C，HDL3-C。HDL2-C與斑塊的厚度成正相關(guān)，也就是說它促進(jìn)斑塊厚度的增加。HDL3-L與斑塊的厚度成反比，也就是說它對動(dòng)脈有保護(hù)意義，且HDL3-C與動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病的的保護(hù)比總HDL-C相關(guān)性更強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)仍有不足之處，總體數(shù)量較少，各組之間數(shù)據(jù)收集欠完整，還需后續(xù)更多大樣本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探索相關(guān)機(jī)制。

綜上所述：血清中CyPA水平是頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的危險(xiǎn)因素，但與斑塊的穩(wěn)定性不相關(guān)；腦梗死患者中的斑塊不穩(wěn)定程度較非腦梗死患者斑塊不穩(wěn)定程度明顯增加，提示斑塊破裂與腦梗死的發(fā)生息息相關(guān)；纖維蛋白原及糖化血紅蛋白會(huì)加重斑塊的不穩(wěn)定性，而血紅蛋白和高密度脂蛋白是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的保護(hù)因素。