軸突起始段與神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究

宋彬彬 楊 璇 甄 然 于 佳

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和單位，高度極化，由胞體和較長的突起(軸突和樹突)構(gòu)成。哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中在胞體-樹突區(qū)(somatodendritic domain)和軸突之間存在神經(jīng)元動作電位啟始的特定部位，稱為軸突起始段(AIS)。AIS對于維持神經(jīng)元極性和功能，建立完整的神經(jīng)元回路非常重要[1]。本文主要對軸突起始段的結(jié)構(gòu)、功能、可塑性及其相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行綜述。

一、軸突起始段的結(jié)構(gòu)

AIS是起始于近胞體的軸丘(axon hillock)至髓鞘開始包繞為止的無髓鞘結(jié)構(gòu)，長度為20～60μm，直徑為0.5～2.0μm。電鏡觀察到大鼠海馬CA3神經(jīng)元AIS縱切面具有膜下致密層和微管束，且核糖體數(shù)量急劇下降。膜下致密層可分為3層，即7.5nm厚連接質(zhì)膜的顆粒層、7.5nm厚中間層和35nm厚下層。微管束由5～8根微管形成，3～10根微管束易聚集，聚集的微管束間距約為40nm，且被蛋白質(zhì)連接。橫切面觀察AIS可分為質(zhì)膜、亞質(zhì)膜和內(nèi)部3部分，由支架蛋白(scaffolding protein)——ankyrin G(Ank G)連接。AIS質(zhì)膜特異性富集多種離子通道和細胞黏附因子(cellular adhesion molecules，CAMs)等跨膜蛋白；亞膜區(qū)具有肌動蛋白(actin)和βⅣ血影蛋白(βⅣ spectrin)等重要的細胞骨架蛋白；內(nèi)部主要分布神經(jīng)纖維、微管束和肌動蛋白絲(actin filaments)[2]。肌動蛋白絲可形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沿軸突中心均勻分布，間隔為180～190nm，支撐細胞骨架。AIS特殊組成和結(jié)構(gòu)對于其維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和起始動作電位具有重要作用[3]。

Ank G是AIS中富集的早期定位蛋白，對于招募AIS相關(guān)蛋白和微管成束有重要作用。ankyrins N端具有Ank重復序列的膜結(jié)合域(membrane binding domain，MBD)，中間具有ZU5結(jié)構(gòu)域、UPA結(jié)構(gòu)域、神經(jīng)元外顯子區(qū)域和“死亡域”(death domain，DD domain)，C端具有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。MBD可直接與鈉離子通道、鉀離子通道、神經(jīng)束蛋白186(neurofascin-186，NF-186)和神經(jīng)細胞黏附分子(neuronal cell adhesion molecule，NrCAM)結(jié)合[4]。ZU5結(jié)構(gòu)域可與βⅣ spectrin結(jié)合。Ank G與不同蛋白質(zhì)相互作用機制不同，磷酸化的鈉鉀離子通道與Ank G的親和力增加，而細胞黏附因子NrCAM和NF186通過FIGQY基序與Ank G結(jié)合，F(xiàn)IGQY基序中酪氨酸磷酸化會減弱其與Ank G的結(jié)合。Ank G S2417A突變使βⅣ spectrin在AIS定位明顯減少，但不會影響Ank G和NF186在AIS 聚集。而Ank G DAR999AAA突變雖可破壞Ank G ZU5結(jié)構(gòu)域與βⅣ spectrin結(jié)合能力，但對βⅣ spectrin在軸突近端的聚集無顯著影響[5]。AIS中存在兩種肌動蛋白絲類型：短而穩(wěn)定的肌動蛋白絲和長而不穩(wěn)定的肌動蛋白絲。AIS中環(huán)狀結(jié)構(gòu)主要由短而穩(wěn)定的肌動蛋白絲末端被內(nèi)收蛋白(adducin)加帽形成，通過βⅣ spectrin與NF186-Ank G-Nav復合物相連，主要作用于AIS選擇性屏障的形成。而長而不穩(wěn)定的肌動蛋白絲可促進AIS膜下致密層重組[6]。Ank G也可通過微管正端示蹤蛋白EB1和EB3與微管相連，穩(wěn)定微管晶格，促進微管成束[7]。AIS中微管成束是神經(jīng)元極化的早期特征。微管束在AIS形成過程中可以捕獲AIS結(jié)構(gòu)組分，并且選擇性透過胞質(zhì)蛋白，對于AIS的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用[8]。

二、AIS的功能

1.維持神經(jīng)元極性：AIS對于維持軸突完整性和神經(jīng)元極性具有重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)10天的海馬神經(jīng)元軸突遠端(≥35μm)橫切后誘導軸突再生，不影響神經(jīng)元極性。而軸突近端(<35μm)橫切后受損軸突中軸突標志物tau-1陰性，而樹突末端延長，且tau-1陽性，樹突標志物MAP2陰性，提示樹突轉(zhuǎn)變?yōu)檩S突樣結(jié)構(gòu)。這說明AIS是維持成熟神經(jīng)元極性的重要部位[9]。AIS中Ank G 、βⅣ-spectrin和actin等形成特殊的細胞骨架可作為選擇性屏障，特異性允許軸突蛋白和脂質(zhì)等通過，而屏蔽胞體和樹突內(nèi)物質(zhì)的進入。Petersen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中，樹突囊泡可從胞體向軸突中運輸3～10μm，在AIS近側(cè)突然停止后返回胞體或與質(zhì)膜融合，而軸突囊泡可勻速通過AIS進入軸突。藥物處理神經(jīng)元使actin細胞骨架解聚可破壞AIS和蛋白質(zhì)分選，使樹突囊泡進入軸突，且長距離順向運輸。另有研究發(fā)現(xiàn)，AIS中Ank G可招募動力蛋白(dynein)活性調(diào)節(jié)因子Lis1(lissencephaly 1)和NDEL1(nuclear distribution protein nudE-like 1)，從而激活dynein將胞體-樹突貨物從AIS逆行運輸回胞體[11]。

2.動作電位起始：AIS中聚集大量的鈉離子(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.6)、鉀離子Kv1(Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4)、Kv2(Kv2.1、Kv2.2)、Kv7 (Kv7.2/KCNQ2、Kv7.3/KCNQ3)電壓門控通道，是調(diào)節(jié)神經(jīng)元動作電位起始的重要結(jié)構(gòu)。鈉離子通道中Nav1.6具有最低激活閾值，對動作電位起始具有主要作用。而Kv1 和Kv7可抵消鈉離子通道，抑制動作電位起始。Kv2被動作電位激活后可加速動作電位復極化，促進重復放電。AIS中也存在鈣離子電壓門控通道(Cav2.1、Cav2.2、Cav2.3、Cav3)，Cav2.3、Cav3可促進動作電位起始，而Cav2.1、Cav2.2抑制動作電位產(chǎn)生[12]。且AIS中離子通道組成具有細胞類型特異性和AIS分布特異性，鈉、鉀、鈣離子通道需協(xié)同調(diào)控動作電位的產(chǎn)生和傳播。另有研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元AIS遠端富集GABAA-α2受體，在細胞黏附因子NF186作用下可特異性與γ-氨基丁酸能(GABAergic) 中間神經(jīng)元形成軸突-軸突突觸，負調(diào)控動作電位起始[13]。

三、 AIS結(jié)構(gòu)和功能的可塑性及其調(diào)節(jié)

1.AIS具有結(jié)構(gòu)和功能可塑性：神經(jīng)元靜息狀態(tài)時AIS為相對靜態(tài)結(jié)構(gòu)，AIS也可根據(jù)神經(jīng)元活性變化調(diào)節(jié)AIS長度、定位和蛋白的表達，具有可塑性。研究發(fā)現(xiàn)，使用 KCl處理體外培養(yǎng)10～12天的海馬興奮性神經(jīng)元3～48h后，使AIS向軸突遠端明顯移動，AIS長度下降25%，AIS中鈉離子通道蛋白和neurofascin等定位減少，且神經(jīng)元興奮性下降，這說明AIS具有結(jié)構(gòu)和功能可塑性[14]。且AIS長度和定位對神經(jīng)元放電和興奮性具有特異性調(diào)節(jié)，當AIS距胞體較近時，AIS長度增加可提高軸突中鈉鉀離子電流傳導，增強神經(jīng)元興奮性。而當AIS距胞體較遠時，AIS增長，神經(jīng)元興奮性下降，這是由于隨著距離增加電荷損耗增大，AIS去極化受到抑制引起的[15]。AIS可塑性具有細胞類型依賴性：(1)15mmol/L KCl分別處理海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元3h，只有CA3神經(jīng)元中AIS長度明顯下降，且GABA+神經(jīng)元AIS縮短不明顯[14]。(2)10mmol/L KCl處理體外培養(yǎng)11天的大鼠嗅球(olfactory bulb，OB)多巴胺能神經(jīng)元24h后，AIS向胞體移動，且長度增加，這與興奮性神經(jīng)元不同。當培養(yǎng)基中10mmol/L KCl更換為10mmol/L NaCl，5天后AIS可恢復到初始位置和長度[16]。

2.AIS可塑性調(diào)節(jié)：(1)磷酸酶和磷酸激酶調(diào)節(jié)：研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元中AIS移位依賴于L型鈣離子通道(L-type VGCCs)激活后鈣離子進入神經(jīng)元，使鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)活化來觸發(fā)。藥物FK506處理海馬齒狀回顆粒細胞(dentate granule cell，DGC)抑制鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)的活性，可消除去極化引起的AIS位移[17]。而FK-506不能阻止多巴胺能神經(jīng)元中去極化引起的AIS長度變化[16]。細胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)廣泛參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元中AIS可塑性。使用藥物Roscovitine單獨處理DGC 6h，抑制CDK5活性，AIS可明顯縮短，且AIS長度與處理時間呈負相關(guān)[14]。Roscovitine處理多巴胺能神經(jīng)元24h，可使AIS不依賴于KCl去極化向胞體移動，且AIS明顯縮短[16]。(2)肌球蛋白調(diào)節(jié)：肌球蛋白(myosin)是沿著肌動蛋白絲運動的分子馬達家族。Evans等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白myosin Ⅱ參與調(diào)控活性依賴的AIS可塑性。體外培養(yǎng)10天的大鼠海馬神經(jīng)元中，myosin Ⅱ活性抑制劑blebbistatin可完全抑制KCl去極化引起的AIS位移和縮短。進一步研究發(fā)現(xiàn)AIS中富集磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，pMLC)，pMLC可激活myosin Ⅱ的收縮活性，且與Ank G 共定位，可促進Ank G在AIS定位和AIS組裝。KCl誘導大鼠海馬神經(jīng)元去極化5min，AIS中pMLC水平下降61%，30min時pMLC下降83%，Ank G下降35%，60min時Ank G和Nav蛋白表達水平下降約40%，這提示去極化時pMLC水平與AIS相關(guān)蛋白含量變化有關(guān)。隨機光學重建顯微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)檢測發(fā)現(xiàn)AIS中pMLC與肌動蛋白環(huán)(actin rings)共定位。actin穩(wěn)定試劑可以完全抑制去極化引起的Ank G下降，緩解pMLC在AIS的減少，這提示actin異常是AIS分解的晚期事件。神經(jīng)元去極化時pMLC水平下降使myosin Ⅱ收縮活性降低，引起actin不穩(wěn)定，參與調(diào)節(jié)AIS結(jié)構(gòu)可塑性[19]。(3)細胞分泌物調(diào)節(jié)：Guo等[20]研究指出神經(jīng)元密度差異可能通過細胞分泌物的含量變化來調(diào)節(jié)AIS可塑性。體外實驗證實大鼠海馬神經(jīng)元密度越小，AIS距胞體的距離越長，神經(jīng)元興奮性降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophin 3，NT3)可通過激活酪氨酸激酶受體TrkB(tyrosine kinase receptor B)和TrkC(tyrosine kinase receptor C)參與調(diào)節(jié)AIS移動，而神經(jīng)生長因子不具有此功能。

四、AIS異常與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

AIS是維持神經(jīng)元極性和功能的重要結(jié)構(gòu)，多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中AIS發(fā)生異常改變，而AIS相關(guān)蛋白突變或可塑性受損也可引起癲癇、腦卒中、認知功能障礙和運動神經(jīng)元病等多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。

1．癲癇：癲癇(epileptic)是由多種原因引起的一種慢性腦功能障礙疾病。離子通道結(jié)構(gòu)和功能改變對癲癇的發(fā)生有密切作用。Nav1.6(由SCN8A編碼)高度富集于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的AIS。Nav1.6 參與調(diào)控動作電位起始，也可通過調(diào)節(jié)持續(xù)鈉電流影響神經(jīng)元興奮性。 Nav1.6由6個跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)N端、C端結(jié)構(gòu)域組成，Nav1.6致病突變(Arg1617 和Arg1872)主要位于其C端，可使鈉離子通道失活受損，神經(jīng)元過度興奮，引起早期嬰兒型癲癇性腦病[21]。Nav1.6 發(fā)揮正常功能與其定位相關(guān)，Nav1.6 N端可與微管結(jié)合蛋白MAP1B相結(jié)合，而N端突變可使二者結(jié)合受損，導致Nav1.6在AIS定位減少，使持續(xù)性鈉電流異常增大，從而與疾病相關(guān)[22]。

2.腦卒中：研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中引起缺血性壞死中心神經(jīng)元中AIS細胞骨架蛋白發(fā)生快速、不可逆的鈣蛋白酶(calpain)依賴性水解[23]。缺血性腦損傷小鼠模型大腦中動脈閉塞6h后，皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生明顯的鈣離子依賴性鈣蛋白酶calpain激活，引起AIS中βⅣ spectrin、Ank G 和Nav特異性水解。體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation )2h后，AIS中βⅣ spectrin 染色強度顯著下降，且可持續(xù)8～10天，使AIS組成發(fā)生不可逆損傷，破壞神經(jīng)元極性[24]。

3.阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)：DNA甲基化異常與AD發(fā)生相關(guān)。Sanchez-Mut等[25]利用AD患者尸檢皮質(zhì)樣本和小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)Spnb4(spectrin beta 4)基因高度甲基化。而Spnb4基因編碼的SPTBN4蛋白可與Ank G結(jié)合，SPTBN4突變或異?？赡芡ㄟ^與Ank G結(jié)合受損而抑制動作電位起始，改變神經(jīng)元興奮性。而且AD神經(jīng)元中AIS完整可維持tau在軸突定位，負調(diào)控tau錯位積聚。Sun等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠比較，AD小鼠海馬組織中neurofascin蛋白水平下降50%，海馬神經(jīng)元中Nav 1.6分布于整個軸突，且AIS中水平下降。野生型小鼠海馬神經(jīng)元中只有小分子蛋白(10kDa和27kDa)可進入軸突，而大分子蛋白(90kDa)不能進入軸突。而AD小鼠模型中，大分子和小分子均可進入軸突，提示AIS胞質(zhì)屏障功能受損。Ank G缺失純合小鼠表現(xiàn)出明顯運動缺陷和認知功能障礙[5]。

4.額顳癡呆(frontotemporal dementia，F(xiàn)TD)：微管結(jié)合蛋白tau參與維持AIS結(jié)構(gòu)和功能。tau異常可破壞AIS中Ank G和微管的穩(wěn)定性，改變AIS定位。tau蛋白病-FTD與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常興奮有關(guān)，而AIS結(jié)構(gòu)和可塑性對于調(diào)控神經(jīng)元興奮性至關(guān)重要。最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TD患者多能干細胞衍生的神經(jīng)元中， FTD致病突變tau V337M 通過使EB3在AIS異常積累，EB3與Ank G共定位增加，從而破壞AIS可塑性，使神經(jīng)元異常興奮。

5.運動神經(jīng)元?。涸缙谘芯堪l(fā)現(xiàn)，肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者和小鼠模型脊髓前角神經(jīng)元AIS中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體、神經(jīng)纖維等積累，軸突運輸障礙，AIS腫脹，直徑明顯增加，且這種變化出現(xiàn)于運動神經(jīng)元病早期。

6.其他：全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)研究發(fā)現(xiàn)Ank G編碼基因ANK3是雙相情感障礙(bipolar disorder，BP)高風險因子。精神分裂癥(schizophrenia)患者腦組織尸檢發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)表層椎體神經(jīng)元AIS中Ank G表達下降15%～20%，AIS長度無明顯變化。多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)患者血清樣本中NF186含量明顯增加。2型糖尿病小鼠模型前葉皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元中AIS顯著縮短。皮質(zhì)興奮性神經(jīng)元AIS可與皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞相連，而當腦損傷小膠質(zhì)細胞被激活后，與小膠質(zhì)細胞相連的AIS數(shù)量減少。

五、展 望

綜上所述，AIS是富集Ank G、βⅣ spectrin、細胞黏附因子和離子電壓門控通道等多種組分的特殊軸突起始部位，具有維持神經(jīng)元極性和動作電位起始功能。AIS具有結(jié)構(gòu)和功能可塑性，且AIS可塑性受到磷酸酶和磷酸激酶、肌球蛋白、細胞分泌物等調(diào)節(jié)。在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，AIS組成蛋白或結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生異常改變，這與神經(jīng)元活性受損緊密相關(guān)，故AIS可能作為疾病防治的重要靶標。但AIS組成和病理變化復雜，具有細胞類型依賴性，且多種蛋白質(zhì)間通過不同機制相互作用共同調(diào)控疾病進程。因此AIS在生理、病理條件下的可塑性變化和機制，及其與疾病的關(guān)系亟需深入研究。