微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)冷凍草莓中GⅠ、GⅡ型諾如病毒

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(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266000; 2.山東青島海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,山東青島 266000)

諾如病毒(norovirus,NV)是引起急性無(wú)菌性胃腸炎和兒童腹瀉的主要病原之一,1972年采用免疫電鏡方法,在胃腸炎病人糞便標(biāo)本中檢出一種以前沒(méi)有見(jiàn)到過(guò)的小圓形病毒顆粒,命名為“小圓結(jié)構(gòu)病毒”,“諾瓦克病毒”[1]。諾如病毒可以通過(guò)人與人之間直接傳播,或接觸到被污染的水和食物而進(jìn)行傳播。在日常環(huán)境和烹飪條件下并不能完全殺滅[2-3],從感官體驗(yàn)上幾乎不能判斷食物是否被病毒污染。而人類對(duì)諾如病毒普遍易感,10～100個(gè)病毒粒子即可引發(fā)感染,因此常因食品污染諾如病毒,造成嚴(yán)重的食品安全事件[3]。2012年,德國(guó)學(xué)校食堂發(fā)生了10952人次感染諾如病毒的大面積急性腸胃炎事件,同時(shí)伴隨著腹瀉、嘔吐、高熱等癥狀,調(diào)查顯示是冷凍草莓被污染諾如病毒引起[4]。所以,對(duì)諾如病毒的研究和防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前,諾如病毒不能在體內(nèi)繁殖,也無(wú)動(dòng)物模型,沒(méi)有合適的組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),采用電鏡法、酶聯(lián)免疫法和PCR法檢測(cè)是諾如病毒檢測(cè)的常用方法[5]。在食品中污染的諾如病毒數(shù)量少,一般都少于104copy/10 g,電鏡檢測(cè)的靈敏度為105～106個(gè)病毒粒子/mL,食源性諾如病毒可能超過(guò)電鏡法的最低檢測(cè)限[4-5];酶聯(lián)免疫法也因食品中諾如病毒含量較少,抗原特異性不強(qiáng),導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度過(guò)低,不能滿足日常檢測(cè)要求[6]?，F(xiàn)有的RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)諾如病毒因樣品染毒濃度低,同時(shí)存在檢測(cè)過(guò)程中受抑制物影響而導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)的情況[7]。微滴式數(shù)字PCR原理是將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系,平均分配成數(shù)百萬(wàn)個(gè)PCR反應(yīng)到微滴中,使每個(gè)反應(yīng)中都盡可能含有一個(gè)模板分子,進(jìn)行單分子模板PCR反應(yīng),有熒光信號(hào)記為1,無(wú)熒光信號(hào)記為0,然后經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)泊松分布的校準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)定量[8-10]。

近年來(lái),利用微滴式數(shù)字PCR對(duì)甲型流感病毒進(jìn)行定量分析[10],有學(xué)者通過(guò)對(duì)食品中GⅠ型諾如病毒進(jìn)行研究,以獲得ddPCR在食品致病微生物檢測(cè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)性證據(jù)[11-13]。本文將RT-ddPCR應(yīng)用到冷凍草莓樣品GⅠ和GⅡ型諾如病毒的檢測(cè)中,目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)相同報(bào)道,通過(guò)研究RT-ddPCR用于諾如病毒檢測(cè)的最佳退火溫度、靈敏度、特異性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn),建立了RT-ddPCR檢測(cè)諾如病毒的絕對(duì)定量技術(shù),以期應(yīng)用到小劑量食源性病毒的檢測(cè)中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍草莓 青島海關(guān)出入境檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室各公司送檢散裝樣品,-20 ℃保存,1周內(nèi)檢測(cè);30 U果膠酶(Sigma p2401) 美國(guó)Sigma公司;Tris/Glycine/Beef extract(TGBE)緩沖液(Tris base 12.1 g、甘氨酸3.8 g、牛肉浸出粉10 g、雙蒸水補(bǔ)充至1 L,pH調(diào)節(jié)至9.5,高壓滅菌)、PBS(5×PEG,50 g/100 mL PEG 8000,1.5 mol/L NaCl,高壓滅菌)、1 mol/L鹽酸、氫氧化鈉溶液、氯仿、正丁醇等化學(xué)試劑(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Qiagen RNEASY Mini Kit(74104) 德國(guó)Qiagen公司;One-Step TM PCR Inhibitor Removal Kit 美國(guó)Genemed Synthesis公司;One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes、ddPCRSupermix for Probes(no dUTP) 美國(guó)BIO-RAD公司;AmbionAgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit(AM1005) 美國(guó)ABI公司。

LC480熒光定量PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;QX200 Droplet Digital PCR System 美國(guó)BIO-RAD公司;5804R高速低溫離心機(jī)(50 mL) 德國(guó)Eppendorf公司;BagPageR無(wú)菌勻質(zhì)袋 法國(guó)Interscience公司;MLS-3750高壓滅菌鍋、WDF-U4186S超低溫冰箱 松下健康醫(yī)療器械(上海)有限公司;蛋白核酸檢測(cè)儀 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針 參照ISO/TS 15216-2:2013[14]合成引物與探針,Norovirus GⅠ正向引物:CGC TGG ATG CGN TTC CAT;反向引物:CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC;探針:FAM-TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT-TAMRA。Norovirus GⅡ正向引物:ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA;反向引物:TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA;探針:VIC-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-TAMRA。

1.2.2 樣品前處理 稱取5～10個(gè)冷凍草莓放入帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中,向均質(zhì)袋中加入35 mL已混30 U果膠酶黑曲素的TGBE緩沖液,調(diào)節(jié)pH至9.5,在室溫下60 r/min恒定搖晃孵育20 min。孵育過(guò)程中每隔10 min檢測(cè)樣品pH,若pH小于9.0,則使用NaOH調(diào)節(jié)至pH9.5(酸性水果孵育過(guò)程中會(huì)使pH下降),若調(diào)節(jié)了pH,則應(yīng)延長(zhǎng)10 min的孵育時(shí)間。收集洗脫液于50 mL離心管中,10000×g離心30 min,4 ℃離心澄清,取上清液至新離心管。

1.2.3 病毒富集 使用HCl調(diào)節(jié)上述離心上清溶液酸堿度至7.0,加入四分之一體積的PEG溶液渦旋振蕩1 min,使樣品溶液充分混勻,之后持續(xù)在4 ℃振搖4 h或靜置過(guò)夜。4 ℃條件下10000×g離心30 min,棄上清液,在4 ℃條件下10000×g離心5 min,使沉淀緊實(shí)后用移液槍移去廢液棄掉,加500 μL PBS蝸旋振蕩,使沉淀重新溶解,室溫靜置5 min,4 ℃條件下10000×g離心5 min,吸上清液置于2 mL無(wú)菌離心管,加入等體積有機(jī)溶劑氯仿-正丁醇,蝸旋混合后靜置5 min。4 ℃、10000×g離心15 min,與有機(jī)溶劑混合明顯分層,將上層水相小心移至新離心管中,-20 ℃保存用于提取病毒RNA[8,15]。

1.2.4 病毒RNA提取 按照Qiagen RNEASY Mini Kit(74104)試劑盒說(shuō)明書(shū),提取樣品中病毒RNA,最終溶于100 μL RNase水,-80 ℃保存,用于后續(xù)微滴式數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 陽(yáng)性對(duì)照的制備 諾如病毒原液:由實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)獲得諾如糞便懸液,使用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)10倍稀釋,旋渦振蕩混勻,用離心機(jī)8000×g離心20 min,上清液分裝至1.5 mL離心管,作為陽(yáng)性對(duì)照,-80 ℃貯存?zhèn)溆肹8]。

1.2.6 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以諾如病毒的核酸為模板,使用1.2.1設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增長(zhǎng)度為280 bp,將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至載體,然后轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞,將篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析,序列正確的陽(yáng)性質(zhì)粒即為諾如病毒GⅠ、GⅡ的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.7 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 RT-ddPCR退火溫度的優(yōu)化 退火溫度為引物和模板結(jié)合時(shí)候的溫度參數(shù),是影響 RT-ddPCR特異性的較重要因素,過(guò)低時(shí)可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,過(guò)高時(shí)會(huì)使反應(yīng)的靈敏度下降[15-16]。采用RT-ddPCR推薦的反應(yīng)體系(One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 20 μL),使用同一樣品的RNA核酸,對(duì)退火溫度進(jìn)行研究。根據(jù)信號(hào)讀取結(jié)果判斷優(yōu)化體系。設(shè)置GI,GII型諾如病毒的退火溫度為63.0、62.4、61.4、59.9、58.1、56.5、55.6、55.0 ℃,將擴(kuò)增完的96孔板放進(jìn)QX200微滴讀取儀上,進(jìn)行結(jié)果讀取。雙通道檢測(cè)GI,GII型諾如病毒,根據(jù)信號(hào)讀取結(jié)果判斷最優(yōu)反應(yīng)體系。

表1 RT-ddPCR反應(yīng)條件Table 1 RT-ddPCR reaction conditions

1.2.7.2 RT-qPCR反應(yīng)和 RT-ddPCR反應(yīng) RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL):TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L的上下游引物各1.8 μL,10 μmol/L的探針0.5 μL,RNA模板2 μL,無(wú)RNase超純水3.9 μL。反應(yīng)設(shè)置條件為:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min。

RT-ddPCRddPCRSupermix for Probes(no dUTP)反應(yīng)體系(20 μL):TaqMan mix 10 μL;10 μmol/L的上下游引物各1.8 μL,10 μmol/L的探針0.5 μL,DNA模板2 μL,無(wú)RNase超純水3.9 μL。

反應(yīng)體系(One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 20 μL):Supermix 5 μL,Reverse transcriptase 2 μL,300 nm DTT 1 μL,10 μmol/L的上下游引物各1.8 μL,10 μmol/L的探針0.5 μL,RNA模板2 μL,無(wú)RNase超純水5.9 μL。轉(zhuǎn)移油滴進(jìn)入96孔板,封好膜后在30 min內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng),將擴(kuò)增完的96孔板放進(jìn)QX200微滴讀取儀上,進(jìn)行結(jié)果讀取。

1.2.7.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)和線性關(guān)系分析 將諾如病毒 GⅠ,GⅡ的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋,連續(xù)稀釋8次記為S1～S8,進(jìn)行RT-ddPCRSupermix for Probe實(shí)驗(yàn),記錄拷貝數(shù),確定標(biāo)準(zhǔn)曲線和數(shù)字PCR的檢測(cè)范圍。

1.2.7.4 特異性實(shí)驗(yàn) 用上述1.2.2和1.2.3方法提取諾如病毒,輪狀病毒,腺病毒進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè),確定該實(shí)驗(yàn)方法的特異性。

1.2.7.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 為了證明體系的重復(fù)性,對(duì)樣品重復(fù)3次進(jìn)行RT-ddPCR實(shí)驗(yàn),每1周進(jìn)行檢驗(yàn)一次,連續(xù)3周,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差,判斷該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.8 送檢樣品 對(duì)送檢的草莓樣品進(jìn)行RT-ddPCR定量檢測(cè)。與RT-qPCR進(jìn)行比較,判斷該方法的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用QX200 Droplet Digital PCR System 提供的Quantasoft軟件(Bio-Rad)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果分析

2.1 退火溫度的確定

在不同退火溫度下63.0、62.4、61.4、59.9、58.1、56.5、55.6和55.0 ℃(A01-H01對(duì)應(yīng)8個(gè)溫度梯度)對(duì)GⅠ型諾如病毒進(jìn)行RT-ddPCR反應(yīng),得到如圖1所示散點(diǎn)圖,橫坐標(biāo)表示微滴數(shù),縱坐標(biāo)表示熒光信號(hào)強(qiáng)度,可以直接在Quantasoft軟件上直接讀取微滴數(shù)和拷貝數(shù),對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)分別為91.1、145.5、212、228、229、233、232和228 copies/μL,單個(gè)樣品孔內(nèi)生成的總微滴數(shù)是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)好壞的重要指標(biāo),可接受的平均微滴數(shù)目為10000[10],本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)平均微滴數(shù)為12139,表明所有反應(yīng)的微滴生成正常,陰陽(yáng)微滴有明顯分層,保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的準(zhǔn)確性,在溫度為56.5 ℃時(shí),樣品拷貝數(shù)最高,為233 copies/μL。表明此退火溫度能夠保證 RT-ddPCR法定量檢測(cè)GⅠ型諾如病毒結(jié)果的可靠性,將GⅠ型諾如病毒 RT-ddPCR反應(yīng)的退火溫度選為56.5 ℃。

圖1 諾如病毒GⅠ 8個(gè)溫度梯度RT-ddPCR一維散點(diǎn)圖Fig.1 Temperature gradient ddPCR one-dimensional scatter plot of NV GⅠ

同樣的溫度梯度,對(duì)GⅡ型諾如病毒進(jìn)行RT-ddPCR反應(yīng),得到如圖2所示散點(diǎn)圖,樣品拷貝數(shù)分別為76.9、78.3、67、62.8、72.8、69.3、65.6和71.1 copies/μL。圖2中3526處的短橫線為閾值線,熒光信號(hào)強(qiáng)度為3526時(shí)能更清晰直觀的反映陰陽(yáng)性微滴是否分開(kāi),圖3顯示63和62.4 ℃時(shí),拷貝數(shù)分別為76.9和78.3 copies/μL,陰陽(yáng)微滴界限不明顯,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。圖4顯示在溫度為58.1 ℃時(shí),樣品拷貝數(shù)為72.8 copies/μL,陰陽(yáng)微滴分層明顯,并且分布于中間的不易判定陰陽(yáng)性的微滴數(shù)目較少,微滴數(shù)量和質(zhì)量都較好,說(shuō)明擴(kuò)增效果良好,結(jié)果較為準(zhǔn)確[11]。表明此退火溫度能夠保證RT-ddPCR法定量檢測(cè)GⅡ型諾如病毒的結(jié)果的可靠性。將GⅡ型諾如病毒的RT-ddPCR反應(yīng)的退火溫度選為58.1 ℃。

圖2 諾如病毒GⅡ 8個(gè)溫度梯度RT-ddPCR一維散點(diǎn)圖Fig.2 Temperature gradient ddPCR one-dimensional scatter plot of NV GII

圖3 退火溫度為63、62.4 ℃的 RT-dd PCR法檢測(cè)GⅡ型諾如病毒的直方圖Fig.3 Histogram of GII Norovirus detected by RT-dd PCR with annealing temperature of 63,62.4 ℃

圖4 退火溫度為58.1 ℃的RT-dd PCR法 檢測(cè)GⅡ型諾如病毒的直方圖Fig.4 Histogram of GII Norovirus detected by RT-dd PCR with annealing temperature of 58.1 ℃

2.2 RT-ddPCR線性分析

從圖5、圖6中可以看出,隨著質(zhì)粒濃度降低,陽(yáng)性微滴數(shù)減少,陰性微滴數(shù)增加,生成的微滴數(shù)最低為12134,最多為19432均大于10000,平均為16139,說(shuō)明生成的微滴質(zhì)量和數(shù)量較好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。S1～S3質(zhì)粒濃度過(guò)高,超出檢測(cè)范圍,圖5中GⅠ質(zhì)?？截悢?shù)分別為9000、1934、183、25.6、5.6 copies/μL,圖6中GⅡ質(zhì)?？截悢?shù)分別為7000、659、68.6、9.2和1.8 copies/μL。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),RT-ddPCR檢測(cè)諾如病毒GⅠ標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-0.829x+4.819,決定系數(shù)R2=0.9947,RT-ddPCR檢測(cè)諾如病毒GⅡ標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-0.9035x+4.6543,決定系數(shù)R2=0.995,線性關(guān)系良好,表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖5 GⅠ質(zhì)粒濃度梯度稀釋RT-ddPCR一維散點(diǎn)圖Fig.5 RT-ddPCR one-dimensional scatter plot of GI concentration gradient dilution

圖6 GⅡ質(zhì)粒濃度梯度稀釋RT-ddPCR一維散點(diǎn)圖Fig.6 RT-ddPCR one-dimensional scatter plot of GⅡ concentration gradient dilution

圖7 GⅠ型諾如病毒的線性關(guān)系Fig.7 Linear relationship of GI type norovirus

圖8 GⅡ型諾如病毒的線性關(guān)系Fig.8 Linear relationship of GII type norovirus

2.3 RT-ddPCR特異性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)輪狀病毒,腺病毒均無(wú)明顯擴(kuò)增,A12為諾如病毒的拷貝數(shù)為388 copies/μL,B12、C12為輪狀病毒與腺病毒檢測(cè)結(jié)果No Call,說(shuō)明該方法具有特異性。

表2 RT-ddPCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 2 RT-ddPCR repeatability experiment

圖9 RT-ddPCR特異性試驗(yàn)Fig.9 Specificity test of NoV with droplet digital PCR注：從左往右分別為388 copies/μL,No Call,No Call，空白。

2.4 重復(fù)性

通過(guò)組間重復(fù)和組內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)分析RT-ddPCR的重復(fù)性,結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性進(jìn)行判定[17]。對(duì)提取的GⅡ型諾如病毒RNA進(jìn)行10-1～10-7稀釋,稀釋度為10-1～10-3時(shí),濃度過(guò)高,超出檢測(cè)范圍。在稀釋度為10-7時(shí),RT-ddPCR法的RSD 為3.8%,精密度最好,在稀釋度為10-10即濃度最低時(shí),RT-ddPCR法的RSD為28.78%,精密度最差,說(shuō)明在濃度很低時(shí),RT-ddPCR法的重復(fù)性不佳。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中,應(yīng)注意樣品濃度不宜過(guò)高或過(guò)低,確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.5 應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)

經(jīng)過(guò)病毒富集后,將實(shí)驗(yàn)室送檢諾如病毒陽(yáng)性樣品稀釋,進(jìn)行RT-qPCR和RT-ddPCR定量,微滴式數(shù)字PCR的定量結(jié)果分別為:420、42、4.1、3.9、3.2、1.8 copies/μL。RT-qPCR擴(kuò)增曲線如圖10所示,呈“S”型,從左到右分別表示稀釋度為10-1～10-5時(shí)擴(kuò)增曲線,稀釋度為10-6、10-7時(shí),RT-qPCR與陰性對(duì)照均無(wú)明顯擴(kuò)增,所以RT-qPCR法的靈敏度為稀釋度為10-5的諾如病毒陽(yáng)性樣品的濃度,其Ct值為33.69(Ct<35),而RT-ddPCR在微滴生成正常,滿足泊松分布的條件下,在稀釋度為10-6時(shí)實(shí)測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度為1.8 copies/μL,所以RT-ddPCR法的靈敏度比RT-qPCR法高一個(gè)數(shù)量級(jí)。最低檢測(cè)限低至個(gè)位拷貝數(shù),在RT-ddPCR的檢測(cè)范圍內(nèi),利用建立好的RT-ddPCR的方法對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行了準(zhǔn)確定量,可以運(yùn)用到實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖10 RT-qPCR檢測(cè)不同稀釋度 諾如病毒樣品的RNA擴(kuò)增圖Fig.10 RT-qPCR detection of RNA amplification of different dilutions of Norovirus samples

3 結(jié)論與展望

一步法微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)包括微滴生成器、PCR儀和微滴分析儀三部分組成,檢測(cè)冷凍草莓中的諾如病毒,實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性是由反應(yīng)擴(kuò)增后累計(jì)的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱決定的,而熒光信號(hào)的累積與PCR擴(kuò)增效率密切相關(guān)[18-19]。因?yàn)镽T-ddPCR不受PCR抑制物的影響,PCR擴(kuò)增效率與PCR擴(kuò)增體系中的引物、探針濃度和退火溫度密切相關(guān)[13]。RT-ddPCR是將含有核酸模板的反應(yīng)體系分配成小的PCR反應(yīng),所以RT-qPCR的反應(yīng)體系可能不適合RT-ddPCR反應(yīng),需要對(duì)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到RT-ddPCR的最優(yōu)效果。優(yōu)化RT-ddPCR的退火溫度,確定了RT-ddPCR檢測(cè)GI型、GⅡ型諾如病毒退火溫度為56.5、58.1 ℃。RT-ddPCR的檢測(cè)結(jié)果與GⅠ質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的決定系數(shù)R2=0.9947,與GⅡ質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的決定系數(shù)R2=0.995,說(shuō)明該方法具有良好的線性關(guān)系。濃度過(guò)高超出檢測(cè)范圍時(shí),RT-ddPCR檢測(cè)結(jié)果全為陽(yáng)性,RSD最小為3.8%,表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。在濃度較低時(shí),RT-ddPCR的重復(fù)性不佳。所以在臨床樣品的檢測(cè)中要確保樣品濃度在檢測(cè)范圍內(nèi),使實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本實(shí)驗(yàn)在研究特異性的時(shí)候,因?yàn)椴《緲悠焚Y源的限制,只做了諾如病毒與輪狀病毒、腺病毒的RT-ddPCR反應(yīng),對(duì)輪狀病毒和腺病毒幾乎無(wú)擴(kuò)增,說(shuō)明該方法具有特異性。對(duì)送檢樣品做RT-ddPCR和RT-qPCR作對(duì)比RT-qPCR擴(kuò)增曲線呈“S”型,說(shuō)明熒光定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠,結(jié)果顯示RT-ddPCR最低檢測(cè)限低至個(gè)位拷貝數(shù),RT-ddPCR法的靈敏度比RT-qPCR法高一個(gè)數(shù)量級(jí),說(shuō)明RT-ddPCR靈敏度高。

本研究建立的諾如病毒RT-ddPCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn),但也有自己的不足,濃度過(guò)高超出檢測(cè)線的樣品會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確,閾值線的設(shè)置可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的偏差,反應(yīng)微粒處于閾值線附近的微滴因?yàn)殚撝稻€的變動(dòng),被定義為陰性或者陽(yáng)性,造成錯(cuò)誤的結(jié)果[20]。因此,在樣品檢測(cè)過(guò)程中,需要保證樣品濃度處于檢測(cè)范圍內(nèi),濃度過(guò)高可以稀釋后再檢測(cè)。陰性峰和陽(yáng)性峰明顯分開(kāi),分布在中間不易界定陰陽(yáng)性的微滴數(shù)少,微滴生成平均在一萬(wàn)以上以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。在加樣過(guò)程中,因?yàn)槲⒌伟l(fā)生板不允許出現(xiàn)氣泡,擴(kuò)大1.1倍,配制22 μL體系,使誤差減小。微滴生成器,PCR擴(kuò)增儀和微滴分析儀在使用前進(jìn)行預(yù)熱,達(dá)到機(jī)器使用的最好狀態(tài)。

本研究建立了基于一步法微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)冷凍草莓中諾如病毒絕對(duì)定量的方法,減少了兩步法和熒光定量PCR中可能出現(xiàn)的污染,并可對(duì)臨床樣本中的病毒含量進(jìn)行絕對(duì)定量,該方法的最低檢測(cè)限可以低至個(gè)位拷貝數(shù),給小劑量感染諾如的食品檢測(cè)提供了新方法,對(duì)諾如病毒引起的胃腸炎的防治,監(jiān)測(cè)治療等方面具有重要意義。