啤酒腐敗菌的檢測技術(shù)研究進(jìn)展

余 偲,張寶善,李 娜,劉 巧,李愛萍,孫聿珩,毛偉文,趙 育

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

啤酒作為一種古老的酒精飲料,已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪凶钇毡樽钍軞g迎的飲品。據(jù)相關(guān)部門統(tǒng)計(jì),我國啤酒年產(chǎn)量在2013年達(dá)到峰值5062萬千升,其后逐年下降;2017年,我國人均啤酒消費(fèi)量為31.9升。啤酒通常被認(rèn)為是一種生物穩(wěn)定性較高的飲料,因?yàn)楹幸幌盗胁焕谖⑸锷L的抑制因子,包括啤酒花苦味酸(約為17～55 ppm),酒精(0.5%～10%,w/w),高濃度的二氧化碳(約為0.5,w/v),低pH(pH3.8～4.7),低溶氧量和極低的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。然而,一些微生物仍能在啤酒中生長繁殖,使啤酒腐敗變質(zhì)[2],這些微生物被稱為啤酒腐敗微生物或啤酒腐敗菌(beer spoilage microorganisms)。迄今為止,已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的啤酒腐敗菌達(dá)50多種,主要包括:乳酸菌(lactic acid bacteria)、果膠桿菌屬(Pectinatus)、巨型球菌屬(Megasphaera)和野生酵母(wild yeast)等[3]。其中,革蘭氏陽性乳酸菌為最主要的啤酒腐敗微生物,它能夠耐受啤酒花的脅迫,導(dǎo)致啤酒變粘、渾濁、產(chǎn)酸,同時產(chǎn)生不愉悅的風(fēng)味,影響啤酒的品質(zhì),產(chǎn)生的生物胺等有害物質(zhì)還可能威脅消費(fèi)者的健康,給啤酒廠帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4];因此,必須及時檢測啤酒廠的腐敗菌,并采取相應(yīng)措施進(jìn)行控制,以保證啤酒的質(zhì)量和安全。

表1 啤酒腐敗菌檢測培養(yǎng)基Table 1 Culture medium for detection of beer spoilage microorganisms

注:LAB：乳酸菌;G(-):革蘭氏陰性菌。

然而,對于這些腐敗菌,尤其是腐敗乳酸菌的檢測一直以來都是啤酒工業(yè)的一大難題,也是研究人員研究的重點(diǎn)。本文從方法、原理、優(yōu)缺點(diǎn)等多個方面闡述了近年來國內(nèi)外對啤酒腐敗菌的檢測方法,以期為啤酒生產(chǎn)過程中腐敗菌的檢測提供參考。

1 培養(yǎng)基檢測法

1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)基檢測法

傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測法是將待檢的樣品接種到固體或液體選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng),根據(jù)固體培養(yǎng)基上是否有菌落的生成或者液體培養(yǎng)基是否變渾濁,來檢測啤酒中的腐敗菌污染情況[5]。

國內(nèi)外研究人員已經(jīng)研發(fā)出了眾多選擇性培養(yǎng)基,用于啤酒腐敗菌的檢測(表1)[1，7]。盡管對于林氏乳桿菌(L.lindneri)和類丘狀乳桿菌(L.paracollinoides)這類在培養(yǎng)基上不易生長的菌株[6],Suzuki等[7]研發(fā)出了一種模擬啤酒環(huán)境的ABD(advanced beer detection)培養(yǎng)基,然而至今為止仍未發(fā)現(xiàn)適合所有啤酒腐敗菌生長培養(yǎng)基,且檢測這類菌株也耗時較長。為縮短傳統(tǒng)培養(yǎng)基法的檢測時間,Deng等[8]在MRS(de man,rogosa and sharpemedium)中添加過氧化氫酶,以提高腐敗微生物的生長速度和菌落大小,結(jié)果表明,改良后的培養(yǎng)基能夠較快速的檢測出耐酸乳桿菌(L.acetotolerans),包括一些生長緩慢的腐敗菌在5 d之內(nèi)均被檢測出來。

目前,傳統(tǒng)培養(yǎng)基法仍是啤酒廠檢測腐敗菌最主要的方法,由于具有操作簡單、準(zhǔn)確率高、使用儀器少和前期投資成本低,不受啤酒企業(yè)規(guī)模的限制的優(yōu)點(diǎn),使該檢測方法一直被廣泛沿用。但它的缺點(diǎn)是非常耗時,且實(shí)驗(yàn)步驟繁鎖,需要花費(fèi)大量的人力[5],專一性比較差。

1.2 微菌落法

由于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測方法耗費(fèi)大量的時間和人力,近年來,研究人員通過微菌落法來快速檢測啤酒中的腐敗菌。該法是將單細(xì)胞培養(yǎng)到微小菌落階段(未能用肉眼觀察到時),利用顯微成像技術(shù)捕捉細(xì)胞生長的一種方法[9]。Asano等[10]建立了一種結(jié)合熒光探針羧基二乙酸酯(CFDA)染色的微菌落法來檢測啤酒腐敗菌,結(jié)果表明,熒光微菌落技術(shù)檢測L.brevis需20 h、L.lindneri需62 h左右、L.paracollinoides需40 h左右,相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)基法檢測L.brevis需3 d、L.lindneri需5 d、L.paracollinoides需4～5 d,節(jié)省了大量時間;Zhao等[11]利用微菌落法對用消毒劑處理后的短乳桿菌(L.brevis)進(jìn)行檢測,其檢測時間縮短至2 d,此外,結(jié)合熒光染液PI染色,可以觀察到死細(xì)胞在微菌落中的分布情況。

微菌落法能夠?qū)ζ【聘瘮【M(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測,其實(shí)驗(yàn)周期短、靈敏度高、特異性好[9]。結(jié)合特定的熒光染液,還可以監(jiān)測到單細(xì)胞間的差異。但相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基法它的缺點(diǎn)是需要配備熒光顯微鏡,使檢測成本增加。

2 生物、化學(xué)發(fā)光檢測法

2.1 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生物發(fā)光檢測法

ATP生物發(fā)光法先是由螢火蟲螢光素和ATP反應(yīng)形成螢火蟲熒光素腺苷酸和磷酸,然后螢火蟲熒光素腺苷酸和氧反應(yīng),最終形成氧化熒光素和腺苷單磷酸,同時釋放出焦磷酸(pyrophosphoric acid,PPi)的過程[12];在這一過程中氧化熒光素成為電子激發(fā)態(tài),釋放光子,發(fā)射出可見的黃綠光[13]。但該方法測定的熒光強(qiáng)度和菌落形成單位(colony forming unit,CFU)之間沒有直接關(guān)系,一是因?yàn)槊糠N菌的ATP含量不同,所檢測到的熒光強(qiáng)度中可能還含有酵母和其他非生物的ATP,不只是一種菌中ATP的總量;二是CFU中一個菌落可能是由好幾個細(xì)胞形成的,這就使得推算出的腐敗菌數(shù)量與實(shí)際不符。此外,該方法不適用于檢測含有酵母的啤酒發(fā)酵液,也無法對微生物的種屬進(jìn)行鑒定[14],但是能夠在短時間內(nèi)完成對啤酒腐敗菌的快速檢測。

ATP生物發(fā)光檢測方法的最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、快速和測定范圍廣,能夠滿足清酒和成品啤酒中菌落總數(shù)的快速檢測。但需要樣品中的細(xì)菌濃度(檢出限)高于103CFU/mL,所以在檢測之前通常需要富集培養(yǎng);同時,該方法易受外界環(huán)境干擾,使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性,也不能鑒定微生物種類等的缺點(diǎn)[15]。其反應(yīng)原理如圖1[13]所示:

圖1 ATP與熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)Fig.1 Luminescence reaction of ATP and luciferase

2.2 氧化還原反應(yīng)檢測法

氧化還原反應(yīng)檢測是以多種細(xì)胞脫氫酶輔助因子NADH2的存在為基礎(chǔ),通過檢測微生物細(xì)胞中NAD/NADH和NADP/NADPH氧化還原反應(yīng)的一種化學(xué)發(fā)光法。Preissler等[16]發(fā)現(xiàn)可以通過刃天青由氧化型(藍(lán)色)變?yōu)檫€原型(粉色)來指示啤酒腐敗菌的氧化還原代謝反應(yīng),以檢測腐敗菌的存在和生長。結(jié)果顯示,使用刃天青作為脫氫酶活性的指示劑能夠在2 d內(nèi)區(qū)分腐敗菌株和非腐敗菌株。此方法檢測時間較短,操作方便且價格低廉,同時可以檢測具有難以培養(yǎng)狀態(tài)的菌株,但對所用培養(yǎng)基的pH范圍有一定要求(pH>5.5),使得檢測具有局限性[17]。

3 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)的檢測法

PCR技術(shù)是一種用特異性引物通過PCR儀擴(kuò)增特定DNA片段的方法。該方法在6～10 h內(nèi)便能完成對腐敗菌的測定,加上富集菌體,在2 d之內(nèi)便可完成檢測。除此之外,該方法具有檢測靈敏度高、速度快和專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[18]。但缺點(diǎn)是不能區(qū)分腐敗、非腐敗菌株[19];同時也無法區(qū)分死、活菌株,所以會導(dǎo)致檢測結(jié)果易出現(xiàn)較高的假陽性。但馬艷琳等[20-21]通過將疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide,EMA)或疊氮溴丙錠(propidiummonoazide,PMA)與PCR技術(shù)相結(jié)合來檢測啤酒中的腐敗菌,由于EMA和PMA可以和死細(xì)胞的DNA形成共價化合物,從而使死細(xì)胞的DNA不被擴(kuò)增,使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。

隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展,各種基于PCR的新技術(shù)也被應(yīng)用于啤酒腐敗菌的檢測中,如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA的PCR(RAPD-PCR)、實(shí)時定量PCR(real-time PCR)、多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex PCR)和反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR)等。除此之外,近年來,許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)啤酒腐敗菌中含有與菌種無關(guān)的抗啤酒花基因,這些基因通過單獨(dú)或多重組合存在,具有腐敗啤酒的能力。Zhao[19]總結(jié)了horA、horB、horC、hitA、bsrA、bsrB、arsR、cinA、fabZ等主要啤酒腐敗標(biāo)記基因,日本和加拿大的研究人員通過設(shè)計(jì)特異性引物對上述一系列標(biāo)記基因進(jìn)行檢測,也成功檢測并鑒定出4種啤酒腐敗菌,結(jié)果顯示該方法靈敏度和準(zhǔn)確度高且假陽性低[22-23]。Yin等[24]以horA為靶點(diǎn),建立基于horA基因介導(dǎo)滾動圓放大的啤酒腐敗乳酸菌快速檢測方法,具有靈敏度高、專一性好、操作簡單,還能降低檢測成本的優(yōu)點(diǎn)。因此,這種不依賴菌種特性、基于標(biāo)記基因的PCR檢測方法近年來成為快速檢測啤酒腐敗菌的主要方法之一。然而,啤酒腐敗標(biāo)記基因的數(shù)量和作用一直存在分歧和爭議。有研究報(bào)道,horA、horC和hitA等并非存在于每一個腐敗菌中,且即使存在,那些菌株也未必具有在啤酒中生長的能力[25-26]。所以,基于標(biāo)記基因的PCR檢測技術(shù)不能完全準(zhǔn)確的判斷菌株是否為啤酒腐敗微生物。但隨著全基因組測序技術(shù)和比較基因組分析方法的高速發(fā)展,通過對越來越多未知啤酒腐敗菌進(jìn)行全基因組測序和比對,一定會有更多的啤酒腐敗標(biāo)記基因被發(fā)現(xiàn),并將用于更全面更準(zhǔn)確的檢測啤酒腐敗菌[27,29]。

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù),具有高靈敏性、高特異性,靈敏性是PCR技術(shù)的10倍以上[30]。其操作簡單、快速、無需昂貴的儀器設(shè)備投資,適合現(xiàn)場快速檢測。將LAMP和實(shí)時定量PCR聯(lián)用檢測啤酒腐敗菌時,能夠在1.5 h左右鑒定出啤酒腐敗微生物中的短乳桿菌(L.brevis)、林氏乳桿菌(L.lindneri)、有害片球菌(P.damnosus)和果膠桿菌屬(Pectinatus)[31],極大提高了對擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的靈敏性和特異性。同時該技術(shù)還可以與熒光免疫、化學(xué)發(fā)光、PCR等方法聯(lián)用,能夠降低檢測結(jié)果的假陽性,具有較強(qiáng)的特異性、靈敏性和簡便性,在未來該方法很有可能替代PCR被用來檢測啤酒腐敗菌。但缺點(diǎn)是它對靶序列和引物長度有很高要求,在引物設(shè)計(jì)上難度也很大。

4 基于核酸雜交的檢測方法

4.1 熒光原位雜交(Fluorescencein situ hybridization,FISH)技術(shù)

早在20世紀(jì)90年代早期,FISH就被用作一種新的檢測和識別微生物的技術(shù),且逐漸變得越來越重要。該方法是基于堿基互補(bǔ)的原則[32],利用核酸分子雜交技術(shù)直接探測溶液中或固定在膜上的同源核酸序列[33]。此方法不依賴PCR分子技術(shù),是一種高度特異性的全細(xì)胞檢測技術(shù)。使用時不需要進(jìn)行富集培養(yǎng),因此該方法所需檢測時間短、靈敏度高、特異性強(qiáng),同時還可以檢測到VBNC狀態(tài)的菌株[34]。但是,其探針設(shè)計(jì)比較局限,也易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[35]。

Asano等[10]通過微菌落法和FISH結(jié)合的方法,不僅快速檢測到了樣品中的腐敗菌短乳桿菌(L.brevis)、林氏乳桿菌(L.lindneri)和類丘狀乳桿菌(L.paracollinoides),還降低了結(jié)果的假陰性。因FISH技術(shù)無需進(jìn)行長時間富集培養(yǎng),并能在短時間內(nèi)進(jìn)行定性和定量檢測,能夠滿足啤酒廠快速檢測的要求[36]。因此,基于FISH技術(shù)的試劑盒也應(yīng)運(yùn)而生,如VIT?-beer kit(vermicon AG,Germany),其熒光探針可特異性結(jié)合腐敗菌的rRNA,樣品處理后只需短短3 h便可定量測定出啤酒中的腐敗乳酸菌[13],為啤酒腐敗菌提供了一種簡單、快速的檢測方法。

4.2 寡核苷酸微陣列檢測方法

寡核苷酸微陣列又稱“DNA芯片”,通過特定的儀器對雜交信號進(jìn)行高效地檢測,來分析目的分子的數(shù)量及序列,從而確定檢測樣品中存在的微生物種類和數(shù)量[37]。Weber等[38]把16S～23S rRNA之間的基因間隔區(qū)(ISR)作為靶標(biāo)來檢測活菌,再結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶,將ISR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過寡核苷酸微陣列來鑒定啤酒腐敗菌。Cimaglia等[39]也表明用微陣列法可檢測啤酒中腐敗的酵母、乳酸菌、醋酸菌,并且在很低的濃度(104CFU/mL)就能檢測到,靈敏性更高。

寡核苷酸微陣列方法最突出的特點(diǎn)就是能夠檢測和識別復(fù)雜微生物群落的樣品中單一的細(xì)菌種類,并有高通量的特性,可一次性檢測多種樣品,獲得多種基因的差別表達(dá)圖譜,具有微型化、高效率、低消耗、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。然而,由于分析儀器的成本高、結(jié)果分析較為復(fù)雜等問題,其使用和推廣受到一定的限制。

5 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)

近年來,MALDI-TOF-MS已作為一種高通量工具用于物種水平檢測與鑒定[40]。該方法已成功的應(yīng)用于不同啤酒腐敗菌株的鑒定,不但能區(qū)分腐敗和非腐敗菌株[41],還能對其進(jìn)行物種水平的鑒定,除此之外,該方法也能夠迅速檢測到啤酒中野生酵母的污染,區(qū)別發(fā)酵瓶底部和頂部的發(fā)酵菌[42]。

該方法主要是根據(jù)離子的質(zhì)量-電荷比(m/z)與離子的飛行時間成正比來分析和檢測離子,采集到相關(guān)的微生物蛋白質(zhì)質(zhì)量指紋圖譜[43],再將質(zhì)譜圖中的峰型與已經(jīng)構(gòu)建好的數(shù)據(jù)庫中的參考光譜進(jìn)行比較,以此對微生物進(jìn)行鑒別[41,44]。由于MALDI-TOF-MS鑒定,是通過檢測核糖體蛋白圖譜來進(jìn)行的,因此,它的鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確和直接[45]。Kern等[41]已成功地利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對不同短乳桿菌進(jìn)行鑒定;Turvey等[42]通過對比已建立的參考光譜,用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測和鑒定啤酒腐敗微生物,能夠?qū)⒓?xì)菌和真菌進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測和識別,檢測結(jié)果具有高的精確度;Vávrová等[46]利用MALDI-TOF-MS方法對啤酒污染物直接鑒定并對腐敗菌生物膜進(jìn)行分析,為檢測啤酒中的腐敗菌提供了一種可靠的方法;Wieme等[40]采用該技術(shù),從14個變質(zhì)啤酒中,收集了348種物種進(jìn)行鑒定,其中327株(94%)菌種被直接鑒定出來,表明該方法具有高效性和高準(zhǔn)確性。

將腐敗菌進(jìn)行培養(yǎng)收集通過MALDI-TOF-MS,大約在15 min左右完成檢測,證明它是一種快速有效的檢測方法,同時靈敏度極高、樣品制備簡單、非常適合快速、高通量和準(zhǔn)確識別腐敗菌等[47]。隨著標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫以及分析方法的逐漸完善,該技術(shù)將成為啤酒腐敗菌快速檢測和鑒定的重要手段,總之,MALDI-TOF-MS被認(rèn)為是一種很有前途的新技術(shù)。但該方法最大的缺點(diǎn)是需要建立完善的細(xì)菌檢測和鑒定的標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫[45],檢測前需要富集培養(yǎng);由于該技術(shù)較新,儀器設(shè)備的初始投資成本和后續(xù)維護(hù)費(fèi)用過高,不適合中小型啤酒廠購買和使用。

6 總結(jié)和展望

啤酒一般被認(rèn)為是生物穩(wěn)定性較高的飲料,但仍有一些腐敗菌可以在啤酒中生長,直接威脅著啤酒的質(zhì)量和安全。為了減少啤酒廠的經(jīng)濟(jì)損失,檢測和清除生產(chǎn)過程中的腐敗菌尤為重要,同時,這種檢測技術(shù)需要滿足啤酒工業(yè)的切實(shí)要求,即簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和成本低。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)基方法耗時較長,隨著顯微成像技術(shù)和熒光染色技術(shù)的不斷發(fā)展,微菌落檢測法更快速,信息量更大。同時,分子生物學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,基于PCR和基于核酸雜交檢測啤酒腐敗菌的技術(shù)的不斷出現(xiàn)和更新,使得檢測時間更短、靈敏度更高。當(dāng)然,這些新技術(shù)還存在一定問題,如使用PCR前仍需要富集菌體,菌種特異性的引物不能區(qū)分腐敗菌和非腐敗菌,標(biāo)記基因不能完全準(zhǔn)確的反映菌株是否具有腐敗作用等等;核酸雜交的探針設(shè)計(jì)較為局限,檢測設(shè)備要求較高;MALDI-TOF-MS方法更適合于微生物的鑒定,而不是早期啤酒腐敗菌的檢測。但隨著全基因組測序、生物信息學(xué)等技術(shù)的高速發(fā)展,越來越多的標(biāo)記基因會被發(fā)現(xiàn),探針引物的設(shè)計(jì)也會越來越科學(xué)和全面,檢測價格也會越來越低廉,檢測結(jié)果也會也來越準(zhǔn)確。除此之外,一些新的檢測方法也在不斷的出現(xiàn),楊超等[48]根據(jù)不同腐敗菌產(chǎn)生生物胺、有機(jī)酸、風(fēng)味物質(zhì)的不同,用高效液相進(jìn)行色譜分析,檢測啤酒腐敗菌。因此,在當(dāng)前的啤酒生產(chǎn)檢測中,需要根據(jù)實(shí)際操作條件及環(huán)境,選擇符合啤酒工廠條件的檢測方法進(jìn)行啤酒腐敗菌的診斷,并及時采取相應(yīng)的消毒等衛(wèi)生措施,以保證啤酒的質(zhì)量和安全。