北沙參炮制工藝的優(yōu)化

王鳳嬌，鐘凌云，鐘國(guó)躍，張壽文

（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004）

北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq 的干燥根，夏秋二季采挖，除去須根，洗凈，稍晾，置沸水中燙后除去外皮干燥，或洗凈直接干燥［1］，其性甘、微苦、微寒，歸肺、胃經(jīng)，具有清肺養(yǎng)陰、潤(rùn)肺止咳、益胃生津等功效［2］，主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、糖苷、香豆素等，還含有淀粉、三萜酸、豆甾醇、磷脂、氨基酸等［3］。其中，香豆素類具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用［4］，主要包括補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素等［5］。

北沙參的炮制始于近代，《中藥炮炙經(jīng)驗(yàn)集成》中收載有切制、炒黃、蜜炙、米炒等方法，目前臨床以切段生用為主，但各地炮制規(guī)范中仍有蜜炙存在；2015 年版《中國(guó)藥典》未收錄北沙參飲片含有量的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定其中補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素5 種香豆素的含有量，并以其為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該藥材規(guī)范化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，也為新版《中國(guó)藥典》的修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器 101-1A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海滬粵明科技儀器有限公司）；DFY-400 型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；C21-RK2106 型美的多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；鐵鍋（浙江蘇泊爾股份有限公司）；Raynger ST20 型紅外測(cè)溫儀（美國(guó)Raytek 公司）；SQP 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；AE240 型電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；UItiMate 3000型高效液相色譜儀，配置PDA-3000 型二極管陣列紫外檢測(cè)器、Chromeleon 工作站（美國(guó)Dionex 公司）。

1.2 試劑與藥物 補(bǔ)骨脂素（批號(hào)17061203）、花椒毒素（批號(hào)17072005）、佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)17041303）、歐前胡素（批號(hào)wkq16121908）、異歐前胡素（批號(hào)wkq17050304）對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）。北沙參由內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室葛菲老師鑒定為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq的干燥根。汪氏蜂蜜（江西汪氏蜜蜂園有限公司）。乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 生品制備 取長(zhǎng)短粗細(xì)相似的藥材9 份，按正交試驗(yàn)方案悶潤(rùn)一段時(shí)間、切制一定長(zhǎng)度后放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，設(shè)置不同溫度進(jìn)行干燥，取出，放涼，即得。

2.2 蜜炙品制備 將蜂蜜置于鍋內(nèi)，加熱至徐徐沸騰后改用文火，保持微沸，除去泡沫及上浮蠟質(zhì)，羅篩或紗布濾去死蜂、雜質(zhì)，再傾入鍋內(nèi)，加熱至116～118 ℃，當(dāng)滿鍋魚眼泡、用手捻之有黏性、兩指間無(wú)長(zhǎng)白絲出現(xiàn)時(shí)迅速出鍋，作為煉蜜［1］。取生品各100 g，按正交試驗(yàn)方案加入含一定比例開(kāi)水的煉蜜，拌勻，悶潤(rùn)，置于炒藥鍋中，按設(shè)定的不同溫度（紅外溫度儀測(cè)定鍋溫）炒炙一段時(shí)間，取出，晾涼，篩去碎屑，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件［6-8］Inertsil ODS-3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水，梯度洗脫（0～5 min，40%～45% 乙腈；5～20 min，45%～80% 乙腈；20～30 min，80%～40% 乙腈）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various consituents

2.3.2 對(duì)照品溶液制備［9-10］精密稱取補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品適量，甲醇稀釋定容，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為0.031、0.075、0.065、0.046、0.054 mg／mL）。

2.3.3 供試品溶液制備［11-13］取生品、蜜炙品粉末（過(guò)40 目）各約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、5、8 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為補(bǔ)骨脂素Y＝0.302 3X－0.198 1（r＝0.999 2），線性范圍0.496～7.44 μg／mL；花椒毒素Y＝1.183 2X－0.995 9（r＝0.999 4），線性范圍1.2～18 μg／mL；佛手柑內(nèi)酯Y＝1.686 8X－1.043 3（r＝0.999 3），線性范圍 1.04～15.6 μg／mL；歐前胡素Y＝0.707X－0.507 7（r＝0.999 2），線性范圍0.736～11.04 μg／mL；異歐前胡素Y＝0.973 1X－0.693 5（r＝0.999 1），線性范圍0.864～12.96 μg／mL。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.76%、0.23%、0.12%、0.39%、0.42%，表 明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液10 μL，于0、2、4、12、24 h 在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.57%、0.34%、0.25%、0.31%、0.52%，表 明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一生品粉末6 份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素含有量RSD 分別為0.68%、0.53%、0.34%、0.29%、0.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的生品、蜜炙品粉末各約1 g，各精密稱定6 份，精密加入等量對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，生品中補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素平均加樣回收率（RSD）分別為99.6%（0.63%）、99.8%（0.54%）、100.3%（0.32%）、98.8%（0.28%）、97.8%（0.46%），蜜炙品中分別為99.2%（0.64%）、99.8%（0.54%）、101.2%（0.33%）、98.7%（0.27%）、97.9%（0.48%）。

2.4 炮制工藝優(yōu)化 以潤(rùn)制時(shí)間（A）、切段長(zhǎng)度（B）、干燥溫度（C）為影響因素，正交試驗(yàn)優(yōu)化生品制備工藝，因素水平見(jiàn)表1；以煉蜜與水比例（A）、悶潤(rùn)時(shí)間（B）、炒炙溫度（C）、炒炙時(shí)間（D）為影響因素，正交試驗(yàn)優(yōu)化蜜炙品制備工藝，因素水平見(jiàn)表2。

表1 生品因素水平Tab.1 Factors and levels for raw products

表2 蜜炙品因素水平Tab.2 Factors and levels for honey-fried products

選擇飲片性狀及補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素含有量作為生品評(píng)價(jià)指標(biāo)。參照2015 年版《中國(guó)藥典》北沙參性狀項(xiàng)下規(guī)定，將飲片性狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)確定為表面黃白色80～100 分，表面淡黃白色50～70 分，總分100分；精密吸取對(duì)照品溶液及生品1～9 號(hào)供試品溶液各10 μL，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含有量。再計(jì)算綜合評(píng)分［14］，滿分100 分，公式為：綜合評(píng)分＝飲片性狀評(píng)分×0.5＋補(bǔ)骨脂素含有量×0.1＋花椒毒素含有量×0.1＋佛手柑內(nèi)酯含有量×0.1＋歐前胡素含有量×0.1＋異歐前胡素含有量×0.1，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。由此可知，因素B（切段長(zhǎng)度）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P＜0.05）；最優(yōu)工藝為A2B1C3，即潤(rùn)制24 h后切制5 mm 短段，60 ℃下干燥，烘干，取出，放涼，篩去碎屑。

選擇飲片性狀及補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素含有量作為蜜炙品評(píng)價(jià)指標(biāo)。參照2015 年版《中國(guó)藥典》北沙參性狀項(xiàng)下規(guī)定，將飲片性狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［15］確定為深黃色有光澤40 分，黃色略有光澤30 分，黃白色無(wú)光澤20 分；不黏手30 分，略黏手20 分，黏手10 分；蜜香味濃30 分，有蜜香味20 分，蜜香味淡10 分，滿分100 分，再同法計(jì)算各成分含有量和綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。由此可知，因素A（煉蜜與水比例）、C（溫度）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P＜0.05）；最優(yōu)工藝為A2B2C3D2，即煉蜜與水按1∶1 比例混合后加入干凈飲片，拌勻，悶潤(rùn)40 min，150 ℃（鍋底溫度）下炒炙30 min，取出，放涼，篩去碎屑，每100 kg 飲片加煉蜜25 kg。

表3 生品試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests for raw products

表4 生品方差分析Tab.4 Analysis of variance for raw products

表5 蜜炙品試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.5 Design and results of tests for honey-fried products

表6 蜜炙品方差分析Tab.6 Analysis of variance for honey-fried products

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 取3 份粗細(xì)大小均勻的藥材，按“2.4”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備生品，發(fā)現(xiàn)其表面呈黃白色，質(zhì)堅(jiān)而脆，各成分含有量穩(wěn)定，RSD（n＝3）＜1%；取3 份生品，每份100 g，按“2.4”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備蜜炙品，發(fā)現(xiàn)其表面呈深黃色，不粘手，具有蜜香氣，各成分含有量穩(wěn)定，RSD（n＝3）＜1%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所選取的外觀性狀指標(biāo)是較直觀的色澤、氣味等，可通過(guò)眼觀、鼻聞、手觸等傳統(tǒng)飲片質(zhì)量鑒別方法進(jìn)行考察，可避免單純以化學(xué)指標(biāo)定質(zhì)量的不足，從而可更全面地對(duì)北沙參質(zhì)量進(jìn)行判斷。另外，北沙參中補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、歐前胡素、異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌作用，而佛手柑內(nèi)酯具有抗腫瘤作用，同時(shí)這5 種香豆素又為該藥材主要化學(xué)成分，故以其為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察炮制工藝。

正交試驗(yàn)考察指標(biāo)時(shí)采用了綜合評(píng)分，將外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量相結(jié)合，可較客觀地反映各因素之間的關(guān)系，以及因素水平對(duì)北沙參生品、蜜炙品質(zhì)量的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)該方法篩選出北沙參最佳炮制工藝，在悶潤(rùn)時(shí)間、切制長(zhǎng)度、干燥溫度方面確定了生品具體參數(shù)，而在煉蜜與水比例、悶潤(rùn)時(shí)間、炒炙溫度、炒炙時(shí)間方面確定了蜜炙品的具體參數(shù)，可為規(guī)范藥材炮制、指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)、保證飲片質(zhì)量提供參考依據(jù)。