精子激活在輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用

單芳，胡蓉，王飛苗，吳昕

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，銀川 750004)

精子激活是受精過程中的必要條件。哺乳動物的睪丸精子不運動，缺乏使卵子受精的能力[1]。精子在通過附睪的過程中獲得動能，稱為精子的附睪成熟，這是產(chǎn)生可育精子的絕對必要條件[2]。精子進入女性生殖道后過度活化，不能進行過度活化的活動精子仍不能受精[3]。受精是一個相當復(fù)雜的過程。卵母細胞通過觸發(fā)精子的運動性、趨化性、結(jié)合性及頂體反應(yīng)激活精子，最終融合兩個質(zhì)膜。精子對卵母細胞也有活化作用。精子與卵子結(jié)合，促使卵母細胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，繼而完成受精[4]。在人類輔助生殖技術(shù)(ART)中，部分男性不育患者夫婦可通過ICSI或ICSI聯(lián)合卵子激活的方式成功受精，最終獲得臨床妊娠。但是，某些男性不育患者夫婦仍需借助精子激活改善妊娠結(jié)局[5]。

ICSI的引入，解決了部分男性不孕因素夫婦的生育問題，尤其是少弱精子癥患者[6]。累積證據(jù)表明，用特定培養(yǎng)基稀釋精子樣本可以改善精子功能，提高精子活力[7]。最近的研究旨在通過使用精子激動劑(Spermagic)，結(jié)合精子處理程序，并在傳統(tǒng)培養(yǎng)液中添加己酮可可堿、茶堿等改善少弱精子癥患者的精子活力[8]。

一、精子激活概念

人工輔助精子激活即指對在臨床實驗室標準程序操作中出現(xiàn)運動活力低下的精子或無運動活性的精子通過應(yīng)用化學激活劑、激光、精子激動劑等使其運動活性增強并提高精子運動質(zhì)量[9]。生理情況下，在哺乳動物中，睪丸精子基本靜止，不能使卵母細胞受精[10]。精子離開睪丸時會被一些大分子包裹。這些大分子在穿過附睪小管時逐漸消失，從而使精子獲得運動能力，即精子“獲能”，又稱生理性精子激活[11]。此過程由相關(guān)離子濃度、pH值的逆轉(zhuǎn)、及附睪小管中存在的無機和有機因素支持[12]。精子活力的維持還取決于鈣的存在，并與環(huán)化腺苷酸(cAMP)含量的增加有關(guān)[13]。

二、精子激活機制

通常精子運動活力低下被歸因于腺苷酸環(huán)化酶內(nèi)源性刺激作用不足。該作用主要通過以下三個途徑完成：①通過腺苷酸環(huán)化酶刺激cAMP的產(chǎn)生；②通過抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶來減少cAMP的分解；③通過能由膜擴散的極性類似物來補充細胞內(nèi)的cAMP水平。同時，cAMP可引起cAMP蛋白激酶的激活，繼而使精子活動力增加[14]。目前，在少弱精子癥患者中，精子質(zhì)量與臨床妊娠結(jié)局密切相關(guān)。這些患者通過手術(shù)獲得精子數(shù)量較少，行ICSI很難找到活性精子，這會對后期胚胎發(fā)育和臨床妊娠結(jié)局造成不利影響[15]。人工輔助精子激活可幫助這部分患者在ART過程中實現(xiàn)精子的優(yōu)選，從而獲得更好的臨床妊娠結(jié)局?，F(xiàn)綜述以下幾種人工輔助精子激活方式。

三、精子激活方式

(一)氦氖(He-Ne)激光

在人和動物細胞培養(yǎng)中，使用激光始終顯示出調(diào)節(jié)和刺激細胞增殖的潛力。低強度氦氖(He-Ne)激光輻射可以生物刺激不同哺乳動物物種的精子運動。在冷凍精液儲存過程中，它有助于長期保持精子活力[16]。He-Ne激光輻射提供的生物刺激，可以恢復(fù)冷凍保存的哺乳動物精子活力，對提高哺乳動物精子活力非常有效[17]。這是因為He-Ne激光照射可能在精子線粒體中誘導了電化學勢的增強以及ATP合成的增強，在精子線粒體的能量產(chǎn)生和代謝中起關(guān)鍵作用[18-19]。這僅是一個推測，因為據(jù)報道精子的運動性依賴于Na+依賴性的Ca2+循環(huán)，He-Ne激光輻射可以通過作用于特定的激酶來改變細胞內(nèi)Ca2+的濃度[17-18]。He-Ne激光對精子功能的顯著影響取決于其波長，輸出功率和持續(xù)時間等。一項動物研究表明，He-Ne光波長越短，照射持續(xù)時間越長，對精子活力的提高越明顯[16]。目前，He-Ne激光在人精子活力提高方面應(yīng)用較少。因此，臨床缺乏標準化的激光治療方案，特別是在刺激強度、頻率和持續(xù)時間等方面?？傊琀e-Ne激光的臨床應(yīng)用有望提高男性生育率。值得肯定的是，與生物化學激活方式相比，激光更快，更安全，更容易，不需要事先治療并且可以在ICSI期間進行。但是，由于其成本高昂，對于標準的IVF實驗室來說，激光還不是必需的設(shè)備。

(二) 生物化學激活劑

1.非特異性磷酸二酯酶抑制劑類：己酮可可堿(Pentoxifylline，PTX)和茶堿屬甲基黃嘌呤類似物，是3′5′-核苷酸酶甲基X稀基團的磷酸二酯酶(PDE)抑制劑，可通過防止其分解來提高細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的水平[20]。

PTX是非特異性磷酸二酯酶抑制劑類別中研究最廣泛的運動增強劑，主要用于提高活力較差精子的受精能力[21]。PTX可以提高cAMP的水平，cAMP增加會使精子產(chǎn)生更高的能量代謝活性，從而增強精子活力，啟動獲能過程。PTX也是一種抗氧化劑，可在體外保護精子免受DNA碎片的破壞[22]。PTX已成功地用于改善精索靜脈曲張患者的精液參數(shù)。PTX改善精子活力的適用濃度為2.0～4.0 mmol/L，最佳濃度為4.0 mmol/L，最佳作用時間為1 h，此時精子活力最高，隨時間繼續(xù)延長，其作用效應(yīng)逐漸下降[14]。但是，目前PTX對精子運動的調(diào)節(jié)作用尚有爭議。有學者報告PTX對精子、卵母細胞及胚胎發(fā)育等會帶來有害影響，可能會引起精子頂體反應(yīng)過早發(fā)生，從而導致受精異?；蚴芫系K[23]。因此，由于PTX安全性尚不明確，臨床應(yīng)用仍需謹慎，可優(yōu)先選擇安全性較高的激光、生物素、SperMagic等。

茶堿具有與PTX相同的刺激作用。與PTX相比，茶堿在水中的溶解度較低，并且半衰期(生物利用度)更高，它會在幾分鐘之內(nèi)誘導低運動活性的精子的運動，從而使活性精子的鑒定和分離過程變得更加容易[24]。這減少了胚胎學家進行顯微操作所需的時間，也減少了卵母細胞暴露于室溫下的時間，因此使用起來更方便。茶堿的應(yīng)用將會改善卵子受精率，從而獲得形態(tài)優(yōu)異、生育潛能良好的胚胎。精子一旦暴露于茶堿衍生物，就會向前加速，側(cè)頭偏移增加和輝狀跳動加劇，從而導致細胞能量消耗增加[25]。精子中高濃度cAMP能促進精子持續(xù)進行性運動，呈現(xiàn)超活化狀態(tài)，但是精子運動時cAMP升高的機制尚不清楚，可能是因為磷酸二酯酶受到抑制所引起，也可能是除此以外的其它機制引起的精子胞內(nèi)cAMP的升高。因此，精子暴露于茶堿后的持續(xù)進行性運動效應(yīng)能否持續(xù)數(shù)小時仍需進一步證實。

2.生物素：生物素是一種B復(fù)合(B7)維生素，在生長發(fā)育中起著重要作用。計算機的靶標預(yù)測顯示，酪氨酸蛋白磷酸酶非受體1型(PTP1B)和葡萄糖激酶是生物素的可能靶標。溶液狀態(tài)核磁共振(NMR)研究證實，生物素與人類肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)重組蛋白和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)相關(guān)聯(lián)[21]。在精子洗滌培養(yǎng)基中添加生物素可以提高凍融后人類精子的活力和存活時間，同時改善受精潛力和植入前胚胎的發(fā)育[26]。生物素可以增強在體外條件下人類精子的活力和壽命，并且有助于精子保持較高頻率的進行性運動和體外存活率，這可能與生物素治療組中精子的細胞內(nèi)cAMP水平升高有關(guān)[26-28]。生物素的最佳適用濃度范圍為10～100 nmol/L，生物素在最高濃度100 nmol/L時，不會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生明顯有害影響，甚至可能會對植入前的胚胎發(fā)育產(chǎn)生有益作用[21]。為了安全起見，可從低濃度開始添加，其最佳劑量尚未探明。隨著胚胎孵育時間的增加，適當劑量的生物素可使精子運動性增加，而隨著孵育時間的繼續(xù)增加，精子運動性逐漸下降。生物素為哺乳動物必需微量營養(yǎng)素，因此，它可能是比己酮可可堿更安全的精子活力增強劑[26-27]。目前，生物素安全性尚未探明。生物素可能會對精子DNA完整性及精子線粒體膜的完整性產(chǎn)生一定影響[25-26]，但是研究證據(jù)不足，尚需大樣本研究證實，更廣泛的臨床應(yīng)用仍需謹慎。

3.精子激動劑(SperMagic)：精子激動劑能夠有效提高精子活力。多項研究發(fā)現(xiàn)，在新鮮精液或解凍精液中加入精子激動劑，可以促進鈣離子內(nèi)流并結(jié)合其受體，使精子獲能，增強精子活力[29-33]。這有效縮短了精子注射和卵子體外操作時間，提高了受精率、2PN率、卵裂率和可利用胚胎率，從而間接提高臨床妊娠率。王雪梅等[30]發(fā)現(xiàn)對重度少弱精子癥患者行ICSI過程中加入3 μl精子激動劑可以提高精子活動力，并且對胚胎早期發(fā)育沒有明顯有害影響。另外，在夫精宮腔內(nèi)人工授精助孕技術(shù)中，通過對處理后精液添加精子激動劑，可以明顯改善精子活力[31]。Gu等[5]對96例睪丸穿刺取精(TESE)患者和106例絕對型弱精子癥患者進行了研究，其中對47例TESE患者和68例絕對型弱精子癥患者進行活動精子檢測，并與對照組進行比較。另用精子激動劑培養(yǎng)基刺激49例TESE患者和34例絕對弱精子癥患者的靜止精子。結(jié)果顯示，精子激動劑在受精、卵裂、植入、妊娠、活產(chǎn)和新生兒結(jié)局方面與對照組相比均無顯著差異。因此，精子激動劑培養(yǎng)液不會增加不良新生兒結(jié)局的發(fā)生率，是ICSI過程中選擇活性精子的可靠工具。國內(nèi)外目前對于精子激動劑在臨床上的應(yīng)用報道較少，用于研究的樣本數(shù)量遠遠不夠，在大樣本中對于胚胎發(fā)育參數(shù)的影響及其對子代遠期影響尚不清楚，需要今后進一步的大樣本統(tǒng)計分析。

四、結(jié)論

人工輔助精子激活方式多種多樣。除以上介紹的幾種精子激活方式以外，還有接觸性刺激、咖啡因、左旋肉堿、三磷酸腺苷/硫酸鎂(ATP/MgSO4)和2-脫氧腺苷等方式，但是臨床應(yīng)用較少。本文只說明了幾種較常用精子激活方式。

國內(nèi)外關(guān)于精子激活的報道多為小樣本研究。關(guān)于精子激活周期妊娠和分娩的報道極其有限，精子激活對少弱畸精子癥患者周期是否有效和安全性尚缺乏足夠的證據(jù)?；颊呒{入條件和精子激活方法的不同，使得文獻報道的數(shù)據(jù)難以匯總。目前，幾種精子激活方法安全性都尚無有效證據(jù)證實，仍需今后臨床大樣本研究支持。因此，精子激活在以后的臨床應(yīng)用中需要嚴格把控其適應(yīng)人群，建立有效臨床適應(yīng)指征。