線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜在年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展△

何美芹 韓國鴿 危平輝

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)和線粒體都是動(dòng)態(tài)細(xì)胞器，能調(diào)節(jié)自身的結(jié)構(gòu)和功能來適應(yīng)外部環(huán)境的變化，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1]。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并不是孤立的，通過多個(gè)接觸位點(diǎn)相互作用，這些接觸位點(diǎn)形成線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondrial-associated ER membranes,MAMs)或線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點(diǎn)(mitochondria-ER contact sites,MERCs)。通過這些物理連接定位以蛋白質(zhì)分子作為功能載體，形成強(qiáng)大的功能復(fù)合體。在MAMs平臺(tái)上，2種細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能可以聯(lián)系起來，并且在生理及病理?xiàng)l件下相互調(diào)控相互影響，使復(fù)雜的細(xì)胞間物質(zhì)信號(hào)生化信號(hào)交叉轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)話成為可能。目前，MAMs參與細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為研究熱點(diǎn)。研究顯示，MAMs在許

多與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的病理過程中起調(diào)控作用[2]。本文將分別從磷脂生物合成和運(yùn)輸、鈣穩(wěn)態(tài)、線粒體分裂和融合及自噬等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，以闡明MAMs在年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 MAMs分子組成研究進(jìn)展

研究發(fā)現(xiàn)，MAMs中存在不同的分子，但對(duì)這些分子的生物學(xué)作用至今仍未完全了解。例如，在酵母細(xì)胞中，連接ER和線粒體的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)稱為ER-線粒體結(jié)構(gòu)偶聯(lián)復(fù)合物(ER-mitochondria encounter structure,ERMES)，據(jù)報(bào)道其含有Mdm12、Mdm34、Mdm10和Mmm1蛋白。Mdm12連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Mmm1與線粒體外膜蛋白Mdm34或Mdm10[3]。這種物理上的關(guān)聯(lián)建立了ERMES。哺乳動(dòng)物細(xì)胞有更復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)。Lee等[4]總結(jié)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAMs含有的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，包括MFN2-MFN1/2、BAP31-Fis1、 IP3R-Grp75-VDAC和PTPIP51-VAPB或PTPIP51-ORP5/8連接復(fù)合物，使2個(gè)細(xì)胞器緊密接觸并相互影響。其他蛋白如PS2、PACS-2、Tespa1、SigR1、FUNDC1和MCU，均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體連接復(fù)合物有關(guān)。MAMs中發(fā)現(xiàn)的1212種候選蛋白中常見有：ACAT1、 BiP/GRP78、 calnexin、calreticulin、Erlin-1、Erlin-2、ERP44、HSPA9、MFN1、PDIA3、VDAC1、VDAC2和VDAC3。目前許多研究描述了MAMs蛋白在細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控和衰老過程中的重要作用。MAMs在與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病病理生理中的作用越來越受到關(guān)注[5]。

2 MAMs與Ca2+穩(wěn)態(tài)參與AMD

ER是細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存的主要部位，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的MAMs區(qū)富含1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP3R)。IP3R是位于ER膜上的肌醇三磷酸鈣通道，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的Ca2+流，并參與細(xì)胞分化、存活和細(xì)胞凋亡。Ca2+水平升高激活I(lǐng)P3R-Grp75-VDAC-MCU復(fù)合物，使Ca2+流入線粒體。IP3R 與電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體外膜，當(dāng)連接蛋白GRP75降低時(shí)，線粒體Ca2+水平降低，GRP75通過與IP3R和VDAC相互作用，間接連接ER和線粒體，并且Grp75基因敲除可以防止線粒體中Ca2+過量導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其中與IP3R-Grp75-VDAC-MCU復(fù)合物相關(guān)的蛋白可以調(diào)節(jié)ER與線粒體之間的Ca2+轉(zhuǎn)移[6]。正常情況下，SigR1與BiP相結(jié)合。然而，當(dāng)ER發(fā)生應(yīng)激或配體激活時(shí)，SigR1與BiP解離，與IP3R相互作用導(dǎo)致Ca2+從ER流入線粒體[7]。其他MAMs中促進(jìn)ER和線粒體之間有效Ca2+轉(zhuǎn)移的蛋白包括Tespa-1、VAPB-PTPIP51和MFN復(fù)合物。此外，MAMs蛋白如PACS-2、Bid、Fis1、Bap31等參與細(xì)胞凋亡。由于不同水平的Ca2+可以分別觸發(fā)能量的產(chǎn)生和細(xì)胞的死亡，因此MAMs對(duì)線粒體Ca2+水平的精細(xì)調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。生理狀態(tài)下線粒體Ca2+的上調(diào)激活Ca2+依賴的線粒體酶，促進(jìn)TCA循環(huán)和氧化磷酸化，導(dǎo)致ATP生成增加。而線粒體Ca2+水平持續(xù)或過高則激活細(xì)胞凋亡通路。目前在神經(jīng)退行性疾病中觀察到MAMs的結(jié)構(gòu)和功能缺陷[8]。ER與線粒體的對(duì)話增多在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在生理?xiàng)l件下，神經(jīng)元內(nèi)的ER-線粒體距離受到嚴(yán)格控制。當(dāng)距離減小時(shí)，細(xì)胞質(zhì)和線粒體均發(fā)生Ca2+超載。細(xì)胞質(zhì)Ca2+超載除通過激活caspase途徑外，還可促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)的產(chǎn)生和聚合，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。線粒體Ca2+超載可導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加，線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開放，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[9]。 AMD與AD有類似的發(fā)病機(jī)制，其中Aβ是AD和AMD共同的病理特征[10]。以往組織病理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，軟性玻璃膜疣包含Aβ。Shoda等[11]研究表明，軟性玻璃膜疣面積可能是腦組織中Aβ積累的標(biāo)志物。高濃度的Aβ誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞死亡，并增加VEGF-A的mRNA的表達(dá)，Aβ-RAGE通路可能導(dǎo)致RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF-A和PEDF。說明Aβ與脈絡(luò)膜新生血管形成的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。由此可見線粒體ER對(duì)話異常、Ca2+信號(hào)異常在干性AMD及干性轉(zhuǎn)化為濕性AMD的發(fā)病機(jī)制中扮演重要的角色，但精確的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 MAMs與磷脂合成和運(yùn)輸參與AMD

脂質(zhì)中的磷脂是生物膜的重要組成成分，脂質(zhì)合成主要在ER中進(jìn)行，但仍需線粒體膜上酶的協(xié)同作用，因?yàn)镋R與線粒體具有不同的脂質(zhì)加工酶。線粒體可合成磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、心磷脂(cardiolipin,CL)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)。但是磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)和磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)必須從ER轉(zhuǎn)運(yùn)。PS轉(zhuǎn)入線粒體后，在線粒體內(nèi)膜生成PE。通過MAMs將PS轉(zhuǎn)移到線粒體中是PE生成過程中的限速步驟[12-13]。ER與線粒體的密切接觸對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要。最近研究發(fā)現(xiàn)，ORP5/ORP8定位于ER線粒體接觸點(diǎn)，與線粒體外膜蛋白PTP1P5相互作用，將PS從ER轉(zhuǎn)移至線粒體[14]。ORP5/ORP8的缺失導(dǎo)致線粒體形態(tài)和功能的改變。PC是線粒體的主要脂質(zhì)，最近研究，發(fā)現(xiàn)StarD7可促進(jìn)PC從ER轉(zhuǎn)移到線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)。StarD7-I包含一個(gè)線粒體靶向序列，隨后是一個(gè)跨膜區(qū)域，將蛋白質(zhì)錨定在OMM上。C端START域隨后延伸至細(xì)胞質(zhì)，并在MAMs區(qū)域?qū)C從ER轉(zhuǎn)運(yùn)至OMM[12]。StarD7基因敲除后磷脂合成障礙，抑制StarD7促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生[15]。研究表明，磷脂是視網(wǎng)膜光感受器中重要且高度富集的成分。AMD患者的Bruch膜中巨噬細(xì)胞和含磷脂的碎片共同定位。光照和高氧刺激會(huì)在眼睛中產(chǎn)生大量的氧化磷脂(oxidized phospholipids,oxPLs)，它們可以通過與視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞和巨噬細(xì)胞結(jié)合，激活下游炎癥級(jí)聯(lián)而引發(fā)炎癥反應(yīng)。oxPLs還可能與補(bǔ)體因子H相互作用，參與AMD的發(fā)病機(jī)制[16]。免疫組織化學(xué)染色試驗(yàn)表明，氧化的PC存在于人類正常黃斑區(qū)的光感受器和RPE細(xì)胞中，其水平隨年齡增長而增加。老年性黃斑變性的患眼對(duì)氧化磷脂的免疫反應(yīng)比同年齡正常眼更強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，oxPLs在AMD患眼中表達(dá)增加，并誘導(dǎo)小鼠脈絡(luò)膜新生血管生成[17]。另一項(xiàng)研究表明，oxPCs可上調(diào)原代RPE細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，這一使VEGF過表達(dá)的環(huán)節(jié)是AMD的關(guān)鍵病理過程[18]。根據(jù)以往的研究結(jié)果，磷脂是視網(wǎng)膜的重要結(jié)構(gòu)和功能成分。它們可能在AMD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而，由于目前的進(jìn)展主要處于實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)階段，磷脂代謝與AMD之間的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，MAMs精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制的失衡，造成磷脂合成和運(yùn)輸障礙，在衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用，進(jìn)一步了解其在AMD中的作用有助于發(fā)現(xiàn)AMD的危險(xiǎn)因素和潛在的治療策略。

4 MAMs與線粒體動(dòng)力學(xué)參與AMD

線粒體動(dòng)力學(xué)是指線粒體通過不斷地融合與分裂以保持線粒體穩(wěn)態(tài)。由線粒體分裂和融合蛋白精確調(diào)控完成，包括動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、線粒體融合蛋白1/2(mitofusin-1/2,MFN1/2)及視神經(jīng)萎縮蛋白-1(optic atrophy 1,OPA1)等。線粒體動(dòng)力學(xué)的調(diào)控與線粒體質(zhì)量控制緊密相關(guān)，以保持線粒體的完整性和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。線粒體動(dòng)力學(xué)在維持神經(jīng)功能方面發(fā)揮重要作用，包括生物發(fā)生、線粒體分布和細(xì)胞損傷或死亡。MAMs促進(jìn)線粒體融合和分裂的過程受一組蛋白MFN2、MFN1、DRP1、 Fis1或INF2調(diào)控，這些參與線粒體動(dòng)力學(xué)過程的蛋白均位于MAMs[19]。DRP1、INF2和ER小管一起在線粒體周圍形成收縮環(huán)促進(jìn)線粒體分裂。線粒體分裂的主要蛋白DRP1在線粒體周圍形成螺旋，形成一個(gè)收縮環(huán)，MFN2的突變使MFN2-MFN2相互作用失去功能，導(dǎo)致融合過程下降。MAMs通過破壞ER線粒體的接觸，促進(jìn)線粒體分裂。ER可能通過在MAMs處包圍線粒體參與線粒體分裂，這一步依賴于肌動(dòng)蛋白聚合，INF2基因突變可破壞線粒體收縮所需的肌動(dòng)蛋白聚合步驟。Sig1R功能的紊亂擾亂了MAMs功能，Sig1R的缺失可以阻止線粒體分裂,使線粒體長度增加，線粒體動(dòng)力學(xué)缺陷[20]。原位雜交表明，在RPE細(xì)胞中存在Sig1R mRNA。Sig1R可能在維持RPE細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，RPE細(xì)胞功能失調(diào)促進(jìn)AMD的發(fā)生和進(jìn)展[21]。線粒體動(dòng)力學(xué)異常參與了神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元退化的發(fā)病機(jī)制，此外線粒體動(dòng)力學(xué)也受到線粒體鈣水平的影響[22]。Alaimo等[23]首次報(bào)道光損傷導(dǎo)致RPE細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)失調(diào)。A2E與藍(lán)光一起觸發(fā)RPE細(xì)胞凋亡，激活Caspase-3。藍(lán)光和A2E負(fù)載和非負(fù)載ARPE-19細(xì)胞均能誘導(dǎo)線粒體融合/分裂失衡，導(dǎo)致線粒體破碎，與線粒體蛋白水平(OPA1、DRP1和OMA1)的失調(diào)節(jié)有關(guān)。ARPE-19細(xì)胞敲除OPA3后，應(yīng)激纖維水平、細(xì)胞長度、細(xì)胞遷移和線粒體伸長顯著增加。相反，ARPE-19細(xì)胞中加強(qiáng)表達(dá)OPA3，抑制了F-actin重排和誘導(dǎo)線粒體破碎[24]。研究線粒體動(dòng)力學(xué)過程可能有助于研究AMD的病理機(jī)制。雖然MAMs中的蛋白質(zhì)分子如何精確調(diào)控RPE細(xì)胞線粒體分裂和融合仍不清楚，目前的研究結(jié)果表明，MAMs參與的線粒體動(dòng)力學(xué)的調(diào)控可能對(duì)視網(wǎng)膜退行性病變(如AMD)具有潛在治療價(jià)值。

5 MAMs與自噬參與AMD

自噬，是一種真核生物進(jìn)化上保留的細(xì)胞過程，需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體等細(xì)胞器的相互作用以及共同參與。細(xì)胞內(nèi)的成分包括受損的細(xì)胞器和聚集的蛋白質(zhì)，被特殊的雙層膜包裹稱為自噬體，與溶酶體系統(tǒng)融合，從而促進(jìn)其內(nèi)容物的降解，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物可被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，循環(huán)利用。自噬是對(duì)RPE中持續(xù)存在的許多應(yīng)激刺激發(fā)生反應(yīng)，如缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥或未折疊蛋白反應(yīng)。此外，自噬發(fā)生在幾乎所有細(xì)胞的基礎(chǔ)水平，自噬的改變被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病的原因之一。有證據(jù)表明，ER線粒體接觸位點(diǎn)參與自噬小體的形成，MAMs中的許多蛋白對(duì)自噬囊泡的形成是必需的[25]。ER蛋白VAPB與線粒體外膜蛋白PTPIP51形成VAPB-PTPIP51復(fù)合物，作為支架連接兩個(gè)細(xì)胞器。Gomez-Suaga等[26]研究發(fā)現(xiàn)，VAPB-PTPIP51復(fù)合物調(diào)節(jié)自噬，VAPB或PTPIP51表達(dá)增加以加強(qiáng)ER-線粒體緊密接觸會(huì)抑制自噬形成，而siRNA介導(dǎo)的基因敲除抑制VAPB或PTPIP51表達(dá)使其接觸疏松，促進(jìn)自噬形成。MAMs區(qū)域被認(rèn)為是自噬體的起源[27]。自噬蛋白在眼中高度表達(dá)，對(duì)神經(jīng)視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞的健康均至關(guān)重要。包括RPE細(xì)胞在內(nèi)的衰老細(xì)胞自噬失調(diào)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集物的積累、細(xì)胞退化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有證據(jù)表明，自噬流減弱會(huì)增加AMD的脂褐變和RPE細(xì)胞損傷[28]。當(dāng)自噬能力隨著ROS生成和蛋白聚集的增加而下降時(shí)，如RPE變性和AMD，它可能激活炎性小體，從而在視網(wǎng)膜細(xì)胞中引發(fā)低級(jí)別炎癥反應(yīng)，加速衰老過程。最近發(fā)現(xiàn)的線粒體自噬不僅被認(rèn)為是一種自噬，而且是控制線粒體質(zhì)量控制機(jī)制的一個(gè)重要和獨(dú)特的部分。近年來隨著對(duì)線粒體自噬的研究深入，認(rèn)為線粒體自噬損傷可能在AMD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。線粒體自噬是RPE細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激的重要保護(hù)機(jī)制，可防止視網(wǎng)膜退化。位于MAMs區(qū)域的FUNDC1(FUN14 domain containing 1)是新發(fā)現(xiàn)的線粒體自噬受體蛋白。 Wu等[29]研究表明，F(xiàn)UNDC1是一種在缺氧條件下誘導(dǎo)線粒體分裂和線粒體自噬所必需的線粒體外膜蛋白，與ER 駐留蛋白CANX (calnexin)相互作用，隨著線粒體自噬的進(jìn)行，F(xiàn)UNDC1與CANX解離，更好地募集DNM1L/DRP1來驅(qū)動(dòng)線粒體分裂，以應(yīng)對(duì)低氧應(yīng)激。在衰老細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)線粒體自噬活性降低。衰老細(xì)胞中mTORC1活性升高，溶酶體超載可破壞自噬/線粒體自噬的終末事件，導(dǎo)致了脂褐素在溶酶體內(nèi)的積累，是AMD的一個(gè)標(biāo)志[30]。隨著年齡增長，RPE細(xì)胞線粒體衰退，生物能量缺陷，抗氧化防御下降，對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增加。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，盡管恒河猴以及捐贈(zèng)者人眼的RPE細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少，但是其長度隨年齡增長而增加。因此，線粒體的伸長與代謝/氧化應(yīng)激有關(guān)。另外，拉長的線粒體形成平行的團(tuán)簇，這些團(tuán)簇垂直于細(xì)胞基底膜。在干性AMD患者中，已觀察到與線粒體功能障礙相關(guān)的黃素蛋白熒光升高[31]。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，年齡相關(guān)的線粒體自噬導(dǎo)致的功能障礙可能參與AMD的發(fā)病機(jī)制。

6 結(jié)語

視網(wǎng)膜組織代謝活躍，RPE細(xì)胞、ER和線粒體發(fā)揮各自的功能，并相互制約，MAMs作為交叉對(duì)話的關(guān)鍵部位，在RPE細(xì)胞正常功能的維持及病理?xiàng)l件下RPE細(xì)胞功能異常，促進(jìn)干性AMD發(fā)生及干性向濕性方向的轉(zhuǎn)化方面的作用需進(jìn)一步深入研究。隨著對(duì)ER線粒體交叉對(duì)話機(jī)制研究的深入，其在AMD治療靶點(diǎn)上將會(huì)有突破，在預(yù)防和治療黃斑變性方面意義重大。