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    康柏西普對豚鼠形覺剝奪性近視的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制分析△

    2020-08-10 04:12:40劉奇奇高洪蓮劉蓓李欣蒙于睿張磊
    眼科新進(jìn)展 2020年8期
    關(guān)鍵詞:眼軸屈光度豚鼠

    劉奇奇 高洪蓮 劉蓓 李欣蒙 于睿 張磊

    近視已成為全球第二大致盲原因。在東亞、東南亞地區(qū),青少年近視患病率高達(dá)80%~90%,其中高度近視患病率為10%~20%[1]。高度近視增加了白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜脫離、黃斑變性等病理性眼病的患病率,這將預(yù)示著由病理性近視引起的低視力和失明人口數(shù)量的增加。最近有關(guān)近視的Meta分析結(jié)果顯示,到2050年全球?qū)⒂幸话肴丝诨加薪?,因?控制近視發(fā)生、發(fā)展成為當(dāng)務(wù)之急[2-3]。目前對于近視治療效果較好且應(yīng)用最為廣泛的藥物是硫酸阿托品,它是一種M受體阻滯劑,雖然低劑量阿托品正在試用于臨床[4-6],但是其用于預(yù)防、治療近視相應(yīng)的機(jī)制及可能產(chǎn)生的遠(yuǎn)期副作用尚不明確,遠(yuǎn)期臨床價值有待進(jìn)一步研究;還有一些處于試驗階段的藥物,如7-甲基黃嘌呤、酮咯酸氨丁三醇等,但是治療效果及副作用還需進(jìn)一步研究[7-8]。目前研究已表明,近視主要是眼軸增長引起的,鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑在眼軸增長過程中起關(guān)鍵作用,而基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2,TIMP-2)之間的失衡可造成細(xì)胞外基質(zhì)重塑[9-10]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β主要是通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化以及調(diào)節(jié)MMP-2、TIMP-2水平,進(jìn)而影響細(xì)胞外基質(zhì)合成和分泌的[11-12]。因此,MMP-2、TIMP-2、TGF-β可能是參與近視形成的關(guān)鍵因子。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),適量康柏西普(Conbercept)球結(jié)膜下注射對角膜中MMP-2、TGF-β等因子具有調(diào)節(jié)作用,且對正常角膜無明顯副作用[13]。本研究主要通過眼瞼縫合法建立豚鼠形覺剝奪性近視模型,探討0.5 mg Conbercept球結(jié)膜下注射對豚鼠形覺剝奪性近視形成的干預(yù)作用,并分析其可能的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物普通級3周齡斷乳花色豚鼠48只(山東省濟(jì)南市濟(jì)南西嶺角生物科技有限公司提供),體質(zhì)量150~200 g,雌雄不限,裂隙燈下排除眼病,于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物房飼養(yǎng),采用日光燈予以照明,明暗周期12 h/12 h,喂養(yǎng)環(huán)境溫度維持于22~28 ℃,濕度50%,自由攝食、進(jìn)水。實驗動物的使用符合濱州醫(yī)學(xué)院動物管理委員會制定的動物福利倫理規(guī)定。

    1.1.2 主要試劑與儀器組織RNA快速提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒均購自青島浩賽科技股份有限公司;兔抗鼠MMP-2多克隆抗體(ab97779)、兔抗鼠TIMP-2多克隆抗體(ab180630)、兔抗鼠TGF-β2多克隆抗體(ab102118)、山羊抗兔IgG(H+L)(ab6721)均購自英國Abcam公司;兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體(21898-1-AP)、兔抗鼠GAPDH多克隆抗體(10494-1-AP)均購自Proteintech中國公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自北京碧云天生物科技有限公司;5×蛋白上樣緩沖液購自大連美侖公司。熒光定量PCR儀購自美國伯樂公司。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組及處理采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只豚鼠分為空白對照組、單純手術(shù)組、生理鹽水組、Conbercept組,每組12只。其中,空白對照組:雙眼不進(jìn)行任何干預(yù);單純手術(shù)組:為保證豚鼠正常覓食,左眼不做干預(yù),僅縫合右眼眼瞼;生理鹽水組:縫合右眼眼瞼,并在縫合時、縫合后7 d給予右眼球結(jié)膜下注射0.05 mL生理鹽水;Conbercept組:縫合右眼眼瞼,并在縫合時、縫合后7 d給予右眼球結(jié)膜下注射0.5 mg(0.05 mL)Conbercept(成都康弘生物科技有限公司)。所有術(shù)眼術(shù)后均給予氧氟沙星眼膏涂眼預(yù)防感染。

    1.2.2 眼部生物學(xué)參數(shù)測量分別在眼瞼縫合前、縫合后7 d、縫合后14 d測量各組豚鼠右眼屈光度和眼軸長度。測量后使用手持裂隙燈觀察角膜、結(jié)膜等組織,直接檢眼鏡觀察眼后段。其中,屈光度測量前均使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴右眼,每15 min滴1次,共3次,由同一位檢影驗光經(jīng)驗豐富的專業(yè)臨床檢影師使用帶狀光檢影驗光,連續(xù)檢影5次,取其平均值。眼軸長度測量前均使用鹽酸丙美卡因滴眼液滴右眼,行角膜表面麻醉,由同一位經(jīng)驗豐富的專業(yè)臨床技師使用眼部A超測量儀測量眼軸長度,連續(xù)測量5次,取其平均值。

    1.2.3 標(biāo)本收集每組分別隨機(jī)抽取眼瞼縫合后7 d、14 d豚鼠各6只,使用頸椎脫臼法處死豚鼠后,摘取右眼眼球,于冰塊上快速取后極部鞏膜,保存于-80 ℃冰箱。

    1.2.4 RT-PCR檢測鞏膜中MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1 mRNA的表達(dá)按照組織RNA快速提取試劑盒說明書提取鞏膜中RNA,紫外分光光度計測定所提取RNA濃度,然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)NCBI所提供基因序列,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物序列。按照2×SYBR Green qPCR Mix說明書設(shè)置PCR反應(yīng)條件,使用2-△△Ct法進(jìn)行分析。RT-PCR引物序列:GAPDH上游引物:5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’,下游引物:5’-CAGCGTCAAAAGTGGAAGAATG-3’;MMP-2上游引物:5’-TGCCTGACCCTCTGTTGCT-3’,下游引物:5’-CAGGAGCTGGTTGCTGAGGT-3’;TIMP-2上游引物:5’-GATGTCGGTGGGAAGAAGGA-3’,下游引物:5’-CAATGAAGTCACAGAGGGTGATG-3’;TGF-β2上游引物:5’-GTGGTGATCAGAAAACT-3’,下游引物:5’-CATGCTCCAGCACAGAAGTT-3’;TGF-β1上游引物:5’-TGATAACCTGGATGCCGTTG-3’,下游引物:5’-TGCTTCCAAACTTCACGCTCT-3’。

    1.2.5 Western blot檢測各蛋白表達(dá)收集各組豚鼠鞏膜后于冰上研磨并加裂解液裂解15 min,轉(zhuǎn)移至EP管,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,BCA法測定蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸15 min,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗(MMP-2、TIMP-2、TGF-β1稀釋度均為 11000;TGF-β2稀釋度為1500;GAPDH稀釋度為15000),4 ℃孵育過夜,TBST沖洗3次×10 min,加入二抗室溫孵育2 h,TBST沖洗3次×10 min,化學(xué)發(fā)光法顯影,Image Lab軟件分析灰度值。

    2 結(jié)果

    2.1 眼部生物學(xué)參數(shù)48只豚鼠右眼眼瞼縫合前均呈遠(yuǎn)視狀態(tài),4組間豚鼠右眼眼軸長度、屈光度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。眼瞼縫合后各組豚鼠角膜、結(jié)膜、視網(wǎng)膜等組織均未見明顯異常。眼瞼縫合后7 d、14 d,單純手術(shù)組、生理鹽水組、Conbercept組豚鼠眼軸長度、屈光度與空白對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05),且單純手術(shù)組與生理鹽水組比較,右眼眼軸長度(P7 d=0.704;P14 d=0.382)、屈光度(P7 d=0.596;P14 d=0.927)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。眼瞼縫合后7 d,Conbercept組與生理鹽水組比較,右眼眼軸長度、屈光度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.105、0.723);眼瞼縫合后14 d,兩組豚鼠右眼眼軸長度、屈光度差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001)。見表1。

    表1 各組豚鼠不同時間點右眼眼軸長度、屈光度比較

    2.2 RT-PCR檢測結(jié)果眼瞼縫合后7 d、14 d,單純手術(shù)組與生理鹽水組比較,MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1的mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05);單純手術(shù)組與空白對照組比較,MMP-2、TGF-β2 mRNA相對表達(dá)量均增多,TIMP-2、TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01);Conbercept組與生理鹽水組比較,MMP-2、TGF-β2 mRNA相對表達(dá)量均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05),兩組間TIMP-2 mRNA相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。眼瞼縫合后7 d,Conbercept組與生理鹽水組比較,TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.124),眼瞼縫合后14 d,兩組間TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)。見表2。

    表2 各組豚鼠不同時間點各因子mRNA相對表達(dá)量

    表2 各組豚鼠不同時間點各因子mRNA相對表達(dá)量

    組別MMP-2 mRNA縫合后7 d縫合后14 dTIMP-2 mRNA縫合后7 d縫合后14 dTGF-β2 mRNA縫合后7 d縫合后14 dTGF-β1 mRNA縫合后7 d縫合后14 d空白對照組2.64±0.343.76±0.494.94±0.273.30±0.222.46±2.883.40±0.256.48±1.646.44±1.14單純手術(shù)組71.17±23.66?108.43±9.26?3.00±0.10?1.07±0.15?34.67±2.51?63.33±5.51?3.60±0.10?2.90±0.32?生理鹽水組66.33±11.67111.33±3.713.03±0.251.03±0.2536.33±4.5161.33±5.513.77±0.153.10±0.52Conbercept組38.76±3.25△25.57±0.75△3.23±0.151.40±0.619.17±4.62△9.57±0.58△2.33±0.210.87±0.05△F值28.190559.92776.30344.537202.320301.74011.48733.522P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0010.000

    注:與空白對照組相比,*P<0.01;與生理鹽水組相比,△P<0.05

    2.3 Western blot檢測結(jié)果Western blot檢測結(jié)果顯示,眼瞼縫合后7 d、14 d,單純手術(shù)組與空白對照組比較,MMP-2、TGF-β2蛋白表達(dá)量均增多,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01),TIMP-2、TGF-β1蛋白表達(dá)量均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01);Conbercept組與生理鹽水組比較,MMP-2、TGF-β2、TGF-β1蛋白表達(dá)量均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01),TIMP-2蛋白表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05);單純手術(shù)組與生理鹽水組比較,MMP-2、TGF-β2、TIMP-2、TGF-β1蛋白表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖1。

    圖1 各組不同時間點各因子蛋白表達(dá)情況 A:縫合后7 d時Western blot電泳圖;B:縫合后7 d時各因子蛋白相對表達(dá)量;C:縫合后14 d時Western blot電泳圖;D:縫合后14 d時各因子蛋白相對表達(dá)量。1:空白對照組;2:單純手術(shù)組;3:生理鹽水組;4:Conbercept組

    3 討論

    目前眼科學(xué)者們大多認(rèn)可近視主要是由眼軸增長引起的,鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑是眼軸增長的主要機(jī)制。MMP-2因可降解鞏膜中主要成分Ⅰ型膠原而受到關(guān)注,它可使鞏膜膠原降解增加,進(jìn)而使鞏膜變?。籘IMP-2是MMP-2的抑制因子,可降低鞏膜中膠原的降解;正常情況下兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)兩者平衡打破,鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)代謝發(fā)生異常,導(dǎo)致鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑[14-15]。有研究表明,缺氧引起鞏膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和膠原形成,可造成鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑,進(jìn)而影響近視形成,且抗缺氧藥物可抑制近視形成[16]。肌成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),是細(xì)胞外基質(zhì)合成的主要細(xì)胞,TGF-β是一種調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要因子。以往研究證明,TGF-β2可上調(diào)MMP-2表達(dá),高水平TGF-β1可誘導(dǎo)TIMP-2表達(dá)[11-12]。因此,MMP-2、TIMP-2、TGF-β作為調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)重塑的重要因子,可能參與近視的形成過程。國內(nèi)外已有大量實驗研究證明,近視形成過程中伴隨著MMP-2、TIMP-2、TGF-β等因子活性的改變,以及外源性應(yīng)用調(diào)節(jié)MMP-2、TIMP-2、TGF-β活性的藥物可影響近視形成過程[17-18]。

    Conbercept是由中國研發(fā)的一種抗新生血管生長因子融合蛋白,是一種由VEGFR1的2號決定簇和VEGFR2的3號、4號決定簇與人免疫球蛋白G的Fc段結(jié)合形成的人源化重組融合蛋白,可與VEGF-A、VEGF-B和胎盤生長因子(PIGF)的所有亞型結(jié)合,由于在Fab段添加了VEGFR-2的4號決定簇,因此較其他抗新生血管生成的藥物,如雷珠單抗、貝伐單抗、阿柏西普等對VEGF表現(xiàn)出更高的結(jié)合力[19]。目前,Conbercept主要應(yīng)用于減少VEGF生成以預(yù)防、治療眼部新生血管形成及黃斑部水腫等疾病[20-21]。既往研究發(fā)現(xiàn),貝伐單抗能夠直接或間接影響TGF-β、MMP-2、α-SMA表達(dá)及低劑量抗VEGF藥物聯(lián)合伊馬替尼治療可促進(jìn)形成正常血管,改善缺氧狀態(tài),玻璃體內(nèi)注射阿柏西普、雷珠單抗可影響眼內(nèi)TGF-β、MMP表達(dá)水平[22-23],同時本課題組在Conbercept對兔角膜PRK術(shù)后Haze形成影響的研究中證實,Conbercept同樣可影響角膜中的TGF-β、MMP-2、α-SMA表達(dá)[13]。因此,本實驗主要為研究Conbercept是否對鞏膜中MMP-2、TGF-β、TIMP-2有調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而影響形覺剝奪性近視形成過程,結(jié)果表明,Conbercept也可調(diào)節(jié)鞏膜中MMP-2、TGF-β1、TGF-β2表達(dá)水平,進(jìn)而影響形覺剝奪性近視形成過程。

    本實驗結(jié)果顯示,球結(jié)膜下注射0.05 mL生理鹽水、0.5 mg Conbercept對角膜、結(jié)膜、視網(wǎng)膜等組織均無明顯副作用;單純縫合眼瞼后7 d,便可誘導(dǎo)形成相對近視,此時鞏膜中MMP-2、TGF-β2相對表達(dá)量均顯著提高,TIMP-2、TGF-β1相對表達(dá)量均顯著降低,這與Zhao等[9]、張?zhí)m蘭等[24]的研究結(jié)果一致;球結(jié)膜下注射生理鹽水對形覺剝奪性近視形成過程無明顯影響;0.5 mg Conbercept球結(jié)膜下注射后7 d,與生理鹽水組比較,眼軸長度、屈光度差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義,但MMP-2、TGF-β2相對表達(dá)量均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05),表明球結(jié)膜下注射0.5 mg Conbercept 7 d后(即眼瞼縫合后7 d)已對鞏膜中近視形成相關(guān)因子MMP-2、TGF-β2產(chǎn)生抑制作用;眼瞼縫合后14 d時,Conbercept組與生理鹽水組比較,眼軸長度、屈光度均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05),表明0.5 mg Conbercept對形覺剝奪性近視形成產(chǎn)生抑制作用,同時伴有MMP-2、TGF-β2相對表達(dá)量降低。本實驗中眼瞼縫合后14 d時,Conbercept組中TGF-β1相對表達(dá)量低于生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與以往劉蓓等[13]實驗證實的Conbercept對TGF-β1產(chǎn)生抑制作用相一致??p合后7 d 、14 d,Conbercept組與生理鹽水組比較,TIMP-2相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,可能是由于Conbercept對TIMP-2表達(dá)無調(diào)節(jié)作用或Conbercept對TIMP-2的作用濃度或作用時間不足。本實驗結(jié)果表明,0.5 mg Conbercept球結(jié)膜下注射后7 d便可對形覺剝奪性近視形成過程中鞏膜中的MMP-2、TGF-β2表達(dá)產(chǎn)生抑制作用,注射后14 d時對形覺剝奪性近視形成中眼軸長度、屈光度產(chǎn)生抑制作用。但是本實驗只是從生物學(xué)測量角度表明0.5 mg Conbercept對形覺剝奪性性近視形成有抑制作用,從mRNA、蛋白水平驗證Conbercept對MMP-2、TGF-β2、TGF-β1表達(dá)有抑制作用,其作用的信號通路尚不明確。因此,我們需進(jìn)一步研究Conbercept作用的具體信號通路,為以后抑制近視形成提供新的思路以及預(yù)測Conbercept用于治療近視可能帶來的副作用,同時此次實驗只是研究證明0.5 mg Conbercept對形覺剝奪性近視產(chǎn)生抑制作用,還需在此實驗基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Conbercept對形覺剝奪性近視形成產(chǎn)生抑制作用的最佳濃度、劑量及時間,為以后Conbercept用于臨床控制近視形成提供實驗基礎(chǔ)。

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