NHE1、netrin-1在動脈粥樣硬化中的作用

楊卉，莫顯剛，王蘭，張詩悅

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院綜合病房，貴陽 550004)

冠心病、腦卒中以及周圍血管性疾病是當(dāng)今世界發(fā)病率、病死率最高的一組疾病。目前我國心血管病患病率及病死率處于逐年上升階段，據(jù)2017年《國家心血管病報告》及相關(guān)研究統(tǒng)計顯示，目前我國心血管病患者約為2.9億，其中腦卒中1 300萬，冠心病1 100萬，心血管病死亡占居民總死亡原因的40%以上，居首位[1]。心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)。As是血管難以消退的慢性炎癥性疾病，以單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等吞噬氧化型低密度脂蛋白膽固醇等形成泡沫細(xì)胞，并持續(xù)滯留動脈壁為主要特征[2]。預(yù)計2020年，心血管疾病造成的病死率可高達(dá)36%[3]，對人類的健康生存將造成巨大影響。研究發(fā)現(xiàn)，As斑塊中缺氧或間歇性低氧可促進(jìn)巨噬細(xì)胞滯留于斑塊，缺氧可以抑制巨噬細(xì)胞遷出As斑塊，影響巨噬細(xì)胞遷移抑制因子和巨噬細(xì)胞游走抑制因子表達(dá)[4]。神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子1(netrin-1)及受體UNC5b在巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞滯留動脈粥樣斑塊中起重要作用[3]。鈉氫交換體1(sodium hydrogen exchangers 1，NHE1)通過調(diào)控人和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)pH的動態(tài)平衡影響細(xì)胞的形態(tài)和功能。因此，深入探討As斑塊中導(dǎo)致巨噬細(xì)胞滯留的新機(jī)制，對于尋求抗As治療的新策略具有重要意義?，F(xiàn)就NHE1與netrin-1在As中的作用予以綜述。

1 As的發(fā)病機(jī)制

1.1免疫反應(yīng) As發(fā)展的新免疫學(xué)假定在1997年就已出現(xiàn)[5]，與晚期內(nèi)膜As斑塊相關(guān)的免疫浸潤證明了免疫反應(yīng)存在于As中[6]。然而，對主動脈中免疫細(xì)胞的存在及功能的了解卻很少。Galkina等[7]采用流式細(xì)胞儀定量分析證明了在正常、非炎癥的c57bl/6小鼠主動脈中存在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。Jongstra-Bilen等[8]證明，正常膽固醇血癥C57BL/6小鼠(3～6月齡)的外膜含有T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集，為非炎癥外膜中存在的體質(zhì)免疫細(xì)胞提供了進(jìn)一步的證據(jù)；在As背景下，載脂蛋白E-/-與C57BL/6小鼠相比，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的百分比增加，但T細(xì)胞的百分比沒有變化，B細(xì)胞的百分比降低，這表明免疫細(xì)胞的類型與小鼠發(fā)生As的傾向之間存在聯(lián)系。此外，研究顯示，B淋巴細(xì)胞駐留在主動脈外膜中可能限制早期和過度的As[9]。但需要對正常人體動脈外膜進(jìn)行更多的研究，以充分描述免疫細(xì)胞在As發(fā)展中的特征。

1.2感染 除了充分記載的遺傳和環(huán)境因素外，微生物感染在As的發(fā)生、發(fā)展中也具有重要作用，這是由于As是一種慢性炎癥性疾病，涉及各種炎癥細(xì)胞和因素。細(xì)菌感染通過損傷血管內(nèi)皮和激活全身及局部炎癥免疫反應(yīng)來促進(jìn)As的發(fā)生和進(jìn)展。Evani和Ramasubramanian[10]研究顯示，由感染和高脂血癥引起的膜生物物理變化是肺炎支原體加重As病理的關(guān)鍵機(jī)制之一。這些發(fā)現(xiàn)描述了“傳染性負(fù)擔(dān)”在As發(fā)展中的作用。

1.3缺氧 20世紀(jì)40年代，有學(xué)者提出了動脈斑塊缺氧學(xué)說，但直到21世紀(jì)，學(xué)者們才運(yùn)用新穎的缺氧標(biāo)志物證實了兔As斑塊中缺氧的存在[4]。Parathath等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠As斑塊中存在缺氧，且缺氧可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝及基因表達(dá)。Sluimer等[12]通過給頸動脈粥樣硬化患者注射細(xì)胞缺氧標(biāo)志物哌莫硝唑，發(fā)現(xiàn)As斑塊中存在缺氧；Marsch等[13]通過小鼠實驗進(jìn)一步證實斑塊中缺氧的存在，并參與斑塊不穩(wěn)定的形成；缺氧參與As的主要發(fā)病機(jī)制是炎癥改變，炎癥導(dǎo)致缺氧發(fā)生，缺氧的巨噬細(xì)胞又釋放炎癥介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，As患者的缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α表達(dá)增加，而HIF-1存在于巨噬細(xì)胞及巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞中，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 表達(dá)的增加，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的形成[13]。VEGF是重要的血管生成因子，普遍存在于內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等細(xì)胞表面，VEGF的陽性區(qū)域與內(nèi)膜血管、斑塊內(nèi)出血的數(shù)量具有顯著相關(guān)性[14]。HIF-1作為VEGF的調(diào)控因素可以通過HIF-1/VEGF/VEGF受體2通路促進(jìn)血管生成，增加斑塊的易損性[15]。Marsch等[13]發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)斑塊缺氧可以抑制As斑塊向脆弱表型的進(jìn)展；此外，小鼠斑塊巨噬細(xì)胞從As開始就處于低氧狀態(tài)，進(jìn)一步證實了缺氧與As斑塊的發(fā)生、發(fā)展存在因果關(guān)系。

缺氧可導(dǎo)致ATP耗竭、乳酸堆積、增加蛋白降解和血管新生等，從而促進(jìn)As斑塊的發(fā)生、發(fā)展；缺氧誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放，募集淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷徙，吞噬脂質(zhì)的細(xì)胞釋放更多的促炎癥因子，促進(jìn)斑塊炎癥放大；此外，缺氧時鈣蛋白酶(calpain)的活性增強(qiáng)，這可能因為缺氧時細(xì)胞溶質(zhì)中的鈣離子濃度增加，而微量鈣離子激活了calpain-1[16]。calpain可使HIF-1α積聚，而這種積聚可能涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶作用以及NADPH活化后一系列鈣離子信號通路的激活。在缺氧過程中，NADPH氧化酶大量激活calpain，一方面使HIF-1α積聚，另一方面大量激活的calpain作用于PEST序列，使ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)降解，從而阻止脂質(zhì)流出，使細(xì)胞泡沫化[17]。而As以單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白膽固醇等形成泡沫細(xì)胞，并以持續(xù)滯留動脈壁為主要特征[2]?？傊?，缺氧通過多途徑參與As的形成與發(fā)展。

2 netrin-1、NHE1與As相關(guān)性的研究進(jìn)展

2.1netrin-1與NHE1簡介

2.1.1netrin-1 netrin-1是一種層粘連蛋白，在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，以引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的移動。netrin-1至少存在9種可能受體，如結(jié)直腸癌缺失(deleted in colorectal cancer，DCC)蛋白受體、再生蛋白受體、UNC5a-d、唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子等。netrin-1通過與不同受體結(jié)合，產(chǎn)生化學(xué)吸引和排斥作用。例如，受體UNC5介導(dǎo)神經(jīng)軸突生長排斥作用，而受體DCC介導(dǎo)神經(jīng)軸突生導(dǎo)引或排斥作用，netrin-1受體UNC5在免疫細(xì)胞高表達(dá)，受體DCC低表達(dá)或無表達(dá)，故UNC5抑制免疫細(xì)胞遷徙在免疫調(diào)節(jié)及炎癥中發(fā)揮重要作用[18]。

2.1.2NHE1 NHE1廣泛分布于各種細(xì)胞的細(xì)胞膜，是一種具有815個氨基酸、由2個主要結(jié)構(gòu)域組成的長多肽。NHE1基因分子結(jié)構(gòu)中含有兩個功能區(qū)域，即疏水的N端和親水的C端，NHE的C端(由50～450個氨基酸組成)是細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)區(qū)域，在NHE參與信號通路調(diào)控中發(fā)揮作用；此外，C端還決定NHE1進(jìn)行Na+/H+交換的細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)定點(7.0～7.1)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pH值低于調(diào)定點時，H+與C端功能域結(jié)合激活Na+/H+交換活性，從而決定細(xì)胞內(nèi)pH水平；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pH值正常時，NHE1的活性較低，但當(dāng)pH值下降到6.7時，其活性可較前增加10倍[19-21]。NHE1在心血管疾病方面的研究較多，如在心力衰竭、高血壓、肺動脈高壓、缺血再灌注等方面都有相關(guān)研究報道，此外，在腫瘤、炎癥等方面也有不少研究[22-24]。

2.2netrin-1介導(dǎo)動脈斑塊巨噬細(xì)胞滯留 多項研究發(fā)現(xiàn)了netrin-1在非神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究價值，netrin-1在血管、器官的生成、腫瘤的診斷和預(yù)后以及肺部炎癥、急性腎損傷的表達(dá)和調(diào)節(jié)等方面均起著重要作用[25-28]。Ly等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在急性金黃色葡萄球菌感染時，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞netrin-1的表達(dá)下調(diào)，與UNC5b受體結(jié)合可抑制其遷移，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。Rosenberger等[30]在缺氧模型中再次證實，上皮細(xì)胞表達(dá)的netrin-1可抑制白細(xì)胞的聚集。van Gils等[31]研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠As斑塊的巨噬細(xì)胞中均分泌netrin-1，激活netrin-1及其受體UNC5b可抑制巨噬細(xì)胞對CC趨化因子配體2的定向遷徙，抑制斑塊巨噬細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，基因剔除骨髓來源細(xì)胞的netrin-1，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞從斑塊中遷移，降低斑塊中巨噬細(xì)胞的水平，顯著減少低密度脂蛋白受體-/-小鼠的粥樣斑塊。Ramkhelawon等[32]進(jìn)行的免疫染色顯示，在低氧環(huán)境中，netrin-1和UNC5b在人和小鼠斑塊缺氧區(qū)域的巨噬細(xì)胞中表達(dá)，在體外用氧化型低密度脂蛋白或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物處理的巨噬細(xì)胞中netrin-1和UNC5b信使RNA上調(diào)，且netrin-1在低氧條件下抑制巨噬細(xì)胞凋亡與HIF-1存在直接相關(guān)性；而高水平netrin-1基因的傳遞可以減少單核細(xì)胞的積累，以及炎癥、斑塊的形成；而且通過對人As病變的免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞中netrin-1的豐富表達(dá)，重組netrin-1可通過UNC5b受體阻止單核細(xì)胞遷移。在此基礎(chǔ)上的研究進(jìn)一步證實，netrin-1在As斑塊巨噬細(xì)胞潴留中起重要作用[31-32]，但netrin-1抑制巨噬細(xì)胞遷徙的具體機(jī)制目前尚未完全明確。另有研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的netrin-1會參與內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用，在As初期抑制單核細(xì)胞向動脈內(nèi)膜遷移，進(jìn)而抑制As形成[33]。Oksala等[34]的臨床數(shù)據(jù)顯示，冠狀動脈疾病患者As斑塊中netrin-1下調(diào)，UNC5b上調(diào)，且netrin-1的表達(dá)與炎癥標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，尤其與M2標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證明在巨噬細(xì)胞中netrin-1及其化學(xué)排斥受體UNC5b的表達(dá)失調(diào)與As和不穩(wěn)定的發(fā)展有關(guān)。Moore和Fisher[35]研究顯示，巨噬細(xì)胞中netrin-1的缺失表達(dá)與斑塊中平滑肌細(xì)胞的減少有關(guān)，并促進(jìn)斑塊巨噬細(xì)胞移出。綜上所述，在心血管領(lǐng)域netrin-1可以促進(jìn)血管生成，加速As，同時可保護(hù)心臟免受缺血再灌注損傷，并減少梗死面積。這些發(fā)現(xiàn)使神經(jīng)免疫引導(dǎo)線索netrin-1成為一個重要的治療靶點[36]。

2.3NHE1激活參與As斑塊的發(fā)展 NHE1參與許多復(fù)雜的生理、病理過程，對維持機(jī)體正常的功能狀態(tài)有重要的生物學(xué)意義[37-40]。另有相關(guān)研究表明，小鼠巨噬細(xì)胞系及大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧條件下NHE1信使RNA及蛋白水平增加，而且在HIF-1重組腺病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NHE1表達(dá)顯著升高；同時，缺氧可升高NHE1表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及calpain活性，NHE1激活可促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的重要分子ABCA1降解，而阿米洛利可抑制NHE1活性，從而延緩ABCA1降解[41-42]。也有研究表明，阿米洛利通過阻斷NHE1活性而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的As斑塊形成；此外，相關(guān)研究顯示，普羅布考可通過抑制NHE1而抑制脂多糖，加速As，并促進(jìn)體內(nèi)斑塊的穩(wěn)定性[43]。Karki和Fliegel[44]觀察缺氧/復(fù)氧后NHE1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NHE1蛋白表達(dá)增加使細(xì)胞更容易受到缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的損傷。這些研究表明，NHE1激活可能是As斑塊發(fā)生的重要事件。

2.4NHE1參與netrin-1抑制定向遷徙的機(jī)制 神經(jīng)軸突形態(tài)發(fā)生是神經(jīng)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，軸突末端稱為生長錐，生長錐對于軸突生長方向至關(guān)重要。Sin等[45]研究表明，神經(jīng)細(xì)胞系PC12及小鼠新皮質(zhì)神經(jīng)元生長錐部位NHE1表達(dá)及活性均顯著升高，NHE1抑制劑阿米洛利可減少生長錐偽足數(shù)量，抑制神經(jīng)軸突形成；netrin-1可顯著促進(jìn)神經(jīng)軸突生長；NHE1剔除小鼠神經(jīng)元，netrin-1誘導(dǎo)早期神經(jīng)軸突生長異?？杀籒HE1過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，NHE1是netrin-1誘導(dǎo)神經(jīng)軸突早期形態(tài)發(fā)生及神經(jīng)軸突生長所必需的。NHE1與netrin-1可協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)改變，而細(xì)胞形態(tài)改變是細(xì)胞遷徙所必需的，故兩者可能協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞遷徙運(yùn)動。研究顯示，斑塊中缺氧巨噬細(xì)胞可同時上調(diào)netrin-1和NHE1表達(dá)，而netrin-1可抑制巨噬細(xì)胞遷徙，推測NHE1極有可能通過某種特定機(jī)制參與或調(diào)節(jié)netrin-1的這一效應(yīng)[42]。

此外，細(xì)胞遷徙過程中涉及多個事件的協(xié)同調(diào)控，如細(xì)胞極化、骨架蛋白重排以及局部黏附斑重塑等。細(xì)胞定向遷徙運(yùn)動中，細(xì)胞形態(tài)改變(如細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)不對稱)是必需的，細(xì)胞需形成明確的細(xì)胞前沿及拖尾(即細(xì)胞形態(tài)極化)。細(xì)胞膜G蛋白偶聯(lián)受體激活，進(jìn)而激活Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(如RhoA)及效應(yīng)分子Rho激酶，進(jìn)而促進(jìn)黏著斑蛋白的磷酸化，調(diào)節(jié)骨架蛋白重組[46]。Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)Ⅰ/ROCKⅡ。細(xì)胞前沿的Rho激酶等信號放大以及F-actin聚集，是細(xì)胞極化建立過程中細(xì)胞膜突觸形成的驅(qū)動力，而NHE1在細(xì)胞運(yùn)動的早期細(xì)胞極化中發(fā)揮整合細(xì)胞遷徙信號的重要作用[45]。研究表明，NHE1和埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)直接相聯(lián)系，并共定位在片狀偽足，ROCK激活可促進(jìn)NHE1向片狀偽足前沿聚集[46]；而且NHE1能協(xié)同整合遷徙信號，通過RhoA/ROCK信號途徑以及局部calpain活性改變等放大片狀偽足的不對稱信號，啟動F-actin重組，加速局部黏著斑重組裝[47]。另外，遷徙細(xì)胞的前沿片狀偽足中Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶與NHE1活性之間形成正反饋，促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)極化[48]。在netrin-1誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長中，RhoA/Rho激酶信號通路發(fā)揮著重要作用[49-50]。神經(jīng)生長中，netrin-1/DCC激活RhoA/Rho激酶通路信號，該通路激活可介導(dǎo)netrin-1誘導(dǎo)ERM磷酸化，而ERM蛋白組分中Ezrin表達(dá)缺失可抑制神經(jīng)生長[51]。Rho激酶介導(dǎo)ERM蛋白磷酸化可直接結(jié)合NHE1的胞內(nèi)區(qū)域，進(jìn)而促進(jìn)骨架蛋白F-actin組裝及細(xì)胞骨架改建，而UNC5b主要抑制免疫細(xì)胞對多種細(xì)胞趨化因子的定向移動[19]。鑒于UNC5b介導(dǎo)netrin-1信號及效應(yīng)很大程度上具有DCC介導(dǎo)的相反信號及效應(yīng)的特點，而且遷移細(xì)胞前沿NHE1聚集可通過RhoA/ROCK等信號調(diào)節(jié)，在細(xì)胞極化發(fā)揮整合細(xì)胞遷徙信號的功能[20]，推測，netrin-1激活受體UNC5b，使RhoA/ROCK通路信號被抑制，從而抑制細(xì)胞膜NHE1極性分布，導(dǎo)致ERM蛋白磷酸化被抑制，進(jìn)而抑制細(xì)胞極化及細(xì)胞遷移。

3 小 結(jié)

目前國內(nèi)外關(guān)于NHE1/netrin-1相關(guān)性的研究較少，尤其是心血管疾病方面。netrin-1對早期神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生的促進(jìn)作用受到NHE1表達(dá)和活性降低的抑制，而netrin-1誘導(dǎo)早期神經(jīng)軸突生長異常可被NHE1過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。netrin-1可介導(dǎo)動脈斑塊巨噬細(xì)胞滯留，同時NHE1與As斑塊形成密切相關(guān)。通過不斷的研究，可以揭示NHE1分子的重要功能位點在netrin-1介導(dǎo)巨噬細(xì)胞潴留中的作用及機(jī)制；同時，將斑塊內(nèi)pH值調(diào)控分子與巨噬細(xì)胞潴留直接聯(lián)系起來，可以更好地豐富和發(fā)展As斑塊缺氧生物學(xué)的重要理論意義。希望從干預(yù)缺氧/netrin-1/NHE1的獨(dú)特視角為尋求As及相關(guān)疾病防治提供新的策略。