MTHFR基因C677T及A1298C多態(tài)性與自然流產(chǎn)的關(guān)系

黃中秀，李小蘭，李小松

(重慶市黔江中心醫(yī)院檢驗科，重慶 409000)

自然流產(chǎn)指妊娠28周內(nèi)非人為因素導(dǎo)致的流產(chǎn)，胎兒體重低于1 000 g，其發(fā)生機制尚不明確，主要與遺傳、內(nèi)分泌異常、感染等因素有關(guān)，臨床上約50%的自然流產(chǎn)原因難以明確[1-3]。葉酸為核酸合成、細胞生長、胚胎發(fā)育的重要物質(zhì)，不僅能預(yù)防新生兒出生缺陷(如唇腭裂)，還可減少自然流產(chǎn)的發(fā)生[4]。有學(xué)者指出，孕早期血清葉酸水平可能影響妊娠結(jié)局[5]。葉酸代謝障礙可能增加心臟畸形、肢體畸形等出生缺陷以及妊娠期高血壓等并發(fā)癥的發(fā)生率[6]。目前尚無葉酸代謝障礙的標準定義，臨床常通過基因多態(tài)性檢測進行判斷。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因是葉酸代謝相關(guān)基因之一，研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點突變是自然流產(chǎn)發(fā)生的危險因素[7-8]。由此可見，體內(nèi)葉酸水平可能與自然流產(chǎn)有關(guān)。本研究通過檢測自然流產(chǎn)患者體內(nèi)葉酸、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平以及MTHFR基因C677T、A1298C多態(tài)性，探討葉酸相關(guān)MTHFR基因C677T、A1298C多態(tài)性與自然流產(chǎn)的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年10月至2017年6月在重慶市黔江中心醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的150例自然流產(chǎn)患者作為觀察組，選擇同期230名門診常規(guī)孕檢正常妊娠女性作為對照組。觀察組納入標準：①妊娠28周內(nèi)非人為因素導(dǎo)致的妊娠終止，胎兒體重1 000 g以內(nèi)；②年齡18～40歲；③內(nèi)分泌功能和生殖器結(jié)構(gòu)正常者；④初中及以上文化程度。所有受試者臨床資料完整，均排除器質(zhì)性病變、生殖道感染、夫妻雙方染色體異常、既往自然流產(chǎn)史等因素，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集 收集受試者相關(guān)臨床資料，包括年齡、孕周、分娩史、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、葉酸使用情況等。

1.2.2血清葉酸、Hcy水平檢測 采集受試者清晨空腹外周靜脈血2 mL，離心機分離后將血清保存于-20 ℃冰箱內(nèi)待測。采用直接化學(xué)發(fā)光法通過化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，UniCel DxI 800)檢測血清葉酸水平，采用循環(huán)酶法全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BS-350)檢測血清Hcy水平。

1.2.3MTHFR基因C677T、A1298C多態(tài)性檢測 采集外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管，采用柱式DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司，批號：69504)對樣本DNA進行提取，使用Taqman-MGB探針(美國ABI公司)檢測MTHFR基因C677T、A1298C位點，C677T、A1298C引物序列分別為GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG、CTCCCGCAGACCTTCTCCTTCAA、AAGAACGAAGACTTCAAAGACTT、CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA。反應(yīng)體積10 μL(2X MasterMix、去離子水、DNA模板、20X引物分別為5 μL、3.5 μL、1 μL、0.5 μL)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min后，于92 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s進行20個循環(huán)擴增，再行89 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s 30個循環(huán)擴增。完成后使用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，ABI 7900型)讀取終點熒光，MTHFR C677T包括CC、CT、TT三個基因型。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床資料比較 觀察組與對照組年齡、孕周、分娩史、BMI比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；觀察組圍孕期葉酸使用率低于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組臨床資料比較

BMI：體質(zhì)指數(shù)；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產(chǎn)者；a為t值，余為χ2值

2.2兩組血清葉酸、Hcy水平比較 觀察組血清葉酸水平低于對照組，血清Hcy水平明顯高于對照組(P<0.01)，見表2。

組別例數(shù)葉酸(μg/L)Hcy(μmol/L)對照組23010.92±4.159.37±2.95觀察組1508.76±2.1211.68±3.06t值5.8917.352P值<0.001<0.001

Hcy：同型半胱氨酸；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產(chǎn)者

2.3兩組MTHFR基因C677T多態(tài)性比較 兩組MTHFR基因C677T位點基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(χ2=0.001，P>0.05)，提示樣本具有群體代表性。觀察組MTHFR基因C677T的TT基因型、T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組MTHFR基因C677T基因型、等位基因頻率比較 [例(%)]

MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產(chǎn)者

2.4兩組MTHFR基因A1298C多態(tài)性比較 兩組MTHFR基因C677T位點的基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(χ2=1.056，P>0.05)，提示樣本具有群體代表性。觀察組與對照組MTHFR基因A1298C基因型、等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組MTHFR基因A1298C基因型、等位基因頻率比較 [例(%)]

MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶；對照組：正常妊娠者；觀察組：自然流產(chǎn)者

3 討 論

自然流產(chǎn)對女性生理及心理健康均可造成不同程度的影響，還關(guān)系到其家庭和諧。近年來，由于工作環(huán)境(如美容美發(fā)行業(yè)接觸染發(fā)劑、燙發(fā)劑等化學(xué)試劑)、生育史(既往流產(chǎn)、多次妊娠)、生育政策(二胎政策)、生育年齡偏高等因素的影響，自然流產(chǎn)的發(fā)生率有升高趨勢，因此受到廣泛關(guān)注。趙雪芬和王靜[9]通過Logistic多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)的獨立危險因素包括高齡、孕期陰道出血、孕期感染、有不良妊娠史等，而孕期葉酸補充是自然流產(chǎn)的保護因子。朱燁[10]研究發(fā)現(xiàn)，孕前BMI偏低、文化程度較低、既往流產(chǎn)史是發(fā)生不明原因自然流產(chǎn)的危險因素，而圍孕期口服葉酸、血清高葉酸水平是其保護因素。由此可見，血清低葉酸水平可能增加自然流產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清葉酸水平偏低，口服葉酸后其葉酸代謝異常明顯好轉(zhuǎn)，早期復(fù)發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生率降低，改善了患者的妊娠結(jié)局[11]。

葉酸為人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，具有不耐熱、分子量低的特點[12-13]。綠色蔬菜、水果等食物中葉酸的含量較多，但食物加工過程可導(dǎo)致葉酸的破壞。此外，代謝產(chǎn)物、腸道環(huán)境等因素也可不同程度地影響葉酸的吸收，故食物中葉酸的生物利用度較低。妊娠期女性對葉酸的需求較未妊娠時升高2～4倍，因此孕期葉酸的補充十分必要[14-15]。我國女性備孕前3個月、孕早期3個月需補充葉酸400 μg，但受個體體質(zhì)的影響，臨床上孕婦葉酸缺乏仍較常見[16]。Hcy為蛋氨酸、半胱氨酸代謝的中間產(chǎn)物，被認為是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，血清高Hcy水平易致畸，還可導(dǎo)致胎兒凝血/抗凝系統(tǒng)異常和胎盤栓塞，最終引起胎兒死亡[17-18]。何可人等[19]研究顯示，自然流產(chǎn)患者血清葉酸水平較正常妊娠女性顯著降低，而血清Hcy水平顯著較高，提示低葉酸水平、高Hcy水平可能是妊娠期發(fā)生自然流產(chǎn)的危險因素，本研究與其研究結(jié)果一致，故建議妊娠女性圍孕期適當補充葉酸，以預(yù)防自然流產(chǎn)的發(fā)生。

葉酸在人體DNA的合成及甲基化中發(fā)揮重要作用，妊娠女性葉酸代謝障礙可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)、唐氏綜合征等相關(guān)疾病的發(fā)生[20]。葉酸代謝障礙可能與葉酸代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性異常變化有關(guān)[21-23]。MTHFR是葉酸代謝過程的關(guān)鍵酶之一，定位于1p36.32，由656個氨基酸組成，可將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，5-甲基四氫葉酸可為細胞內(nèi)基因甲基化提供原料，是細胞內(nèi)基因甲基化開始的重要標志，在甲硫氨酸合成酶作用下，5-甲基四氫葉酸與維生素B12結(jié)合，促使血漿Hcy的再甲基化。

C677T、A1298C是臨床較常見的MTHFR基因位點，其中C677T位點突變即核苷酸上胞嘧啶C突變成胸腺嘧啶T，纈氨酸序列上丙氨酸轉(zhuǎn)變成纈氨酸，導(dǎo)致基因型表達蛋白酶活性下降，耐熱性降低，進而促使血清葉酸水平下降以及Hcy水平升高，并對血管內(nèi)皮細胞造成不同程度的損害，促使血小板聚集，從而引發(fā)胎盤病變，最終導(dǎo)致流產(chǎn)[24-26]。臨床上，常通過檢測MTHFR C677T基因型判斷機體葉酸代謝障礙情況，其中CC型表示蛋白酶活性高，葉酸轉(zhuǎn)化能力正常，高Hcy血癥發(fā)生風(fēng)險低等；CT型表示蛋白酶活性及葉酸轉(zhuǎn)化活動能力中等，高Hcy血癥發(fā)生風(fēng)險中等；TT型表示蛋白酶活性低，葉酸轉(zhuǎn)化能力低下，高Hcy血癥發(fā)生風(fēng)險較高。本研究結(jié)果顯示，觀察組MTHFR C677T的TT基因型、T等位基因的頻率均較對照組顯著升高，提示MTHFR C677T基因位點突變可能參與自然流產(chǎn)發(fā)生，C677T可使雜合子基因型、純合子基因型內(nèi)一種熱不穩(wěn)定蛋白酶的活性分別下降35%、70%，易導(dǎo)致Hcy水平升高，進而損害血管內(nèi)皮細胞，引起血小板聚集，導(dǎo)致流產(chǎn)風(fēng)險增加。A1298C分布在MTHFR基因第7外顯子，其突變會導(dǎo)致MTHFR還原酶活性下降，但其對自然流產(chǎn)的影響較MTHFR C677T基因位點突變小。郁長治等[25]研究發(fā)現(xiàn)，新疆維爾族女性自然流產(chǎn)與MTHFRC677T、MTRRA66G有關(guān)，而與A1298C基因位點突變無關(guān)，本研究結(jié)果與上述研究相符。關(guān)于MTHFRC其他基因型以及其他基因?qū)ψ匀涣鳟a(chǎn)的影響仍需進一步深入研究。

影響自然流產(chǎn)的因素較多，如年齡、既往自然流產(chǎn)史等，本研究排除既往自然流產(chǎn)史病例，同時選取年齡、孕周、BMI、分娩史相匹配的正常妊娠女性作為對照，避免了上述因素對研究結(jié)果的影響。但葉酸代謝障礙相關(guān)基因多態(tài)性存在地區(qū)分布的特點，關(guān)于不同地區(qū)葉酸代謝障礙相關(guān)基因多態(tài)性對自然流產(chǎn)的影響尚有待進一步多中心、大樣本的研究。

綜上所述，自然流產(chǎn)患者血清葉酸水平較低，Hcy水平較高，MTHFR C677T可能與自然流產(chǎn)相關(guān)，而A1298C與自然流產(chǎn)無關(guān)。圍孕期女性應(yīng)常規(guī)補充葉酸，以減少自然流產(chǎn)的發(fā)生，提高妊娠成功率；妊娠早期需檢測血清葉酸、Hcy水平，并根據(jù)檢測結(jié)果合理補充葉酸。