食蟹猴在慢性病動物模型藥理研究應(yīng)用中的進(jìn)展

陳少鋒，王河，趙湘培

(廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530001)

實驗動物是各相關(guān)學(xué)科交叉、滲透、綜合的理想工具。而建立理想的人類疾病動物模型又為醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及遺傳學(xué)等生命科學(xué)的各個領(lǐng)域的研究提供了可靠有用的手段和先進(jìn)工具。非人靈長類動物，作為與人類基因以及組織結(jié)構(gòu)最為相近的動物，無疑是醫(yī)藥行業(yè)科研工作者進(jìn)行臨床前研究時選擇的最理想的實驗動物之一。食蟹猴(Macaca fascicularis)為非人靈長類動物，主要分布在亞洲東南部的印度尼西亞、越南、老撾、馬來西亞等國家地區(qū)。由于其具有繁殖周期短、生命周期長，且體型小、性格溫順等特點，被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、藥理學(xué)、生理學(xué)、生殖生物學(xué)以及慢性病模型等其他醫(yī)藥研究，成為一種重要的實驗動物。

慢性疾病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，尤其是慢性肝臟疾病、慢性支氣管炎或肺部疾病、心腦血管疾病、糖尿病，其死亡率很高，因此慢性疾病越來越受到人們的關(guān)注，也是一直以來科研工作者的研究重點。但是，由于該疾病具有病程長、病因復(fù)雜等特點，給臨床前研究造成了一定難度，對疾病動物模型也要求更加嚴(yán)格。食蟹猴動物模型作為現(xiàn)今醫(yī)藥基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)研究的理想工具，其基因、生活習(xí)性和生命周期對于慢性病研究具有很好的優(yōu)越性，本文就近年來國內(nèi)外對食蟹猴在慢性病動物模型的藥理研究應(yīng)用作一探討。

1 食蟹猴模型在肝臟疾病研究中應(yīng)用

肝纖維化是慢性肝病的一種疾病特征，是轉(zhuǎn)化為肝硬化乃至肝癌的重要環(huán)節(jié)[1]。目前在實驗室肝纖維化藥物藥理研究多采用大白鼠建立肝纖維化模型，考慮到人和動物的種屬差別及肝纖維化形成的病因和機(jī)制差距，動物自身的恢復(fù)能力問題等，利用與人類在生理、遺傳及生物學(xué)特性上相似的食蟹猴建立肝纖維化模型是研究人類肝纖維化疾病發(fā)病機(jī)制和防治措施的重要研究工具[2-4]。

陳少鋒等[5]選用3只雄性食蟹猴，采取40%四氯化碳油劑皮下注射，同時配以高脂飼料喂養(yǎng)進(jìn)行肝纖維化模型的建立。分別于實驗開始前、造模80 d、160 d、240 d抽取食蟹猴外周血檢測肝功能指標(biāo)和肝穿活檢、組織病理HE染色進(jìn)行病理形成過程動態(tài)觀測，最終進(jìn)行肝組織病理切片觀察。結(jié)果顯示，食蟹猴的肝纖維化模型發(fā)病進(jìn)程與人類的發(fā)病進(jìn)程高度一致，提示此模型可作為抗肝纖維化藥物臨床前研究的篩選。該團(tuán)隊在此造模方法的基礎(chǔ)上，選用12只食蟹猴，隨機(jī)分成模型組、空白組、給藥高劑量組、給藥低劑量組，除空白組外其余3組造模6個月后，給藥組開始連續(xù)給藥8周，最后通過血清學(xué)檢測、肝組織病理切片提示壯醫(yī)方“白花丹消盅湯”有抗食蟹猴肝纖維化的作用[6-8]。

劉雪萍等[9]采用40%CCl4橄欖油混合劑對食蟹猴灌胃造模，每周灌胃2次，造模第五周開始給予排錢草醇提物高、低劑量治療，給藥同時繼續(xù)造模，實驗總共進(jìn)行16周。實驗過程每4周對食蟹猴進(jìn)行靜脈血清肝功能檢測和纖維指標(biāo)檢測，第8、16周進(jìn)行B超影像學(xué)檢查和肝穿病理組織活檢，第16周在B超輔助下進(jìn)行肝穿活檢組織檢測α-SMA和 TGF-β1肝臟表達(dá)水平。由于食蟹猴模型為此次實驗提供了很好的操作平臺，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計提示排錢草具有抗肝纖維化作用。

由于人體肝纖維化的發(fā)病原因多樣化，而自身免疫反應(yīng)是導(dǎo)致肝纖維化產(chǎn)生的主要原因之一[10]。劉雪萍等[11]利用小牛血清0.4 mL·kg-1劑量，給予食蟹猴皮下注射，每周2次，分別在給藥8周、12周、16周對食蟹猴進(jìn)行肝纖維化相關(guān)指標(biāo)監(jiān)測，結(jié)果顯示連續(xù)造模16周成功建立了食蟹猴免疫性肝纖維化模型。該模型的建立為今后的藥理研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

2 食蟹猴模型在肺部疾病研究中應(yīng)用

肺是人體最重要器官之一，構(gòu)建一個與人體相似度高、治療靶點相似的肺部疾病動物模型是現(xiàn)今實驗室藥理研究的重要任務(wù)。與嚙齒類動物相比，食蟹猴與人類直系同源基因更加相似，其肺部結(jié)構(gòu)與人類相似度更高。食蟹猴是建立肺部疾病動物模型的不二選擇。

宋倩等[12]基于肺部疾病在體外細(xì)胞模型的種類繁多，但種屬和個體的差異，導(dǎo)致不同種類的細(xì)胞株在應(yīng)激和蛋白表達(dá)上也存在差異的特點，利用食蟹猴的新鮮肺部組織，采取30倍體積膠原酶浸泡加以水浴恒溫振蕩消化的方法進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng)，用差速貼壁法進(jìn)行傳代培養(yǎng)獲取穩(wěn)定細(xì)胞株。在體外培養(yǎng)過程中，每天使用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，透射電鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。最后進(jìn)行免疫組化CK(+)、CK-7(+)、波形蛋白(+),染色體分析表明,該研究方法成功建立了國內(nèi)首株食蟹猴肺上皮細(xì)胞。此體外模型的建立，將為肺部疾病的基礎(chǔ)研究及藥物篩選和藥理作用機(jī)制的研究提供良好的食蟹猴體外模型。

肺癌是常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)我國惡性腫瘤死亡率統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌已經(jīng)在所有腫瘤死亡率中排行榜首[13]。因此建立更接近人類、具備人類肺癌特點的動物模型，是臨床前藥理研究的重要工具。周鳳麗等[14]以人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株注入切除脾臟的食蟹猴支氣管黏膜誘導(dǎo)食蟹猴肺癌模型。選用7只食蟹猴，其中一只為對照，每只食蟹猴接種六個部位，接種細(xì)胞濃度分別為1×105個/mL、1×106個/mL、1×107個/mL。實驗過程中，每3個月對食蟹猴進(jìn)行一次肺部CT掃描，對接種部位進(jìn)行一次鏡下觀察和組織病理檢查。結(jié)果顯示，9個月后1只造模成功，12個月后3只造模成功。通過對食蟹猴肺癌造模過程的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，其肺癌發(fā)病進(jìn)程與人類相似度極高，可作為很好的動物模型用于臨床前研究。

3 食蟹猴模型在心血管疾病研究中應(yīng)用

心血管疾病是人類三大慢性疾病之一，嚴(yán)重危害著人類的健康和生活水平。高血壓、高血脂是其常見的兩個臨床特征。利用非人靈長類食蟹猴構(gòu)建與人類近似的病理模型，可以為該類疾病的實驗室研究和臨床前藥效評估研究提供很好的平臺。

夏機(jī)良等[15]使用熒光定量PCR方法對食蟹猴113個心血管病相關(guān)基因進(jìn)行了檢測，并與人心血管病相關(guān)基因表達(dá)模式進(jìn)行了比較，研究結(jié)果顯示在人和食蟹猴外周白細(xì)胞內(nèi)均有有效表達(dá)的心血管病相關(guān)基因有42個，其中22個在人和食蟹猴之間表達(dá)模式完全一致，進(jìn)一步證實食蟹猴心血管疾病模型的研究更適用與人。鄧學(xué)秋等[16]解剖食蟹猴獲取腎動脈直徑數(shù)據(jù)后，通過公式計算出結(jié)扎腎動脈的定量，然后利用絲線和針頭對腎動脈進(jìn)行結(jié)扎，建立腎動脈狹窄性高血壓動物模型。通過彩超和CTA監(jiān)測腎動脈狹窄的形成，對術(shù)前、術(shù)后血液生化指標(biāo)觀察和血壓監(jiān)測,數(shù)據(jù)結(jié)果顯示成功建立食蟹猴高血壓模型，成功率為71.43%。

現(xiàn)今食蟹猴在心血管模型的建立與應(yīng)用方面相關(guān)報道非常少。孫云霄等[17]通過對雄性食蟹猴高敏C反應(yīng)蛋白的變化規(guī)律研究，為靈長類動物在心血管領(lǐng)域的研究提供了參考數(shù)據(jù)。其團(tuán)隊對低齡、中年和老年3個年齡段的食蟹猴進(jìn)行高敏C反應(yīng)蛋白值與總膽固醇關(guān)系變化規(guī)律監(jiān)測，初步確定了各年齡段雄性食蟹猴的hs-CRP值。其中中年食蟹猴輔以高脂飼料喂養(yǎng)，其監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)過高脂飲食誘導(dǎo)的食蟹猴hs-CRP值與膽固醇和低密度脂蛋白呈協(xié)同升高趨勢。該研究的發(fā)現(xiàn)為食蟹猴在心血管模型應(yīng)用提供了很好的參考數(shù)據(jù)。除此之外，唐明甜等[18]采用高糖高脂鼻飼灌喂法，進(jìn)行食蟹猴高脂血癥造模研究。經(jīng)過3個月的連續(xù)灌喂，各處理組食蟹猴均造模成功，21個月的動態(tài)觀察提示此研究方法成功建立了高膽固醇血癥和高低密度脂蛋白血癥食蟹猴模型，為人類對高脂血癥的病理過程研究及藥效評估提供了很好的實驗工具。

4 食蟹猴模型在高血糖疾病研究中應(yīng)用

糖尿病是繼心血管疾病之后，另一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性代謝性疾病，被列為對人類健康威脅最大的三類疾病之一。其發(fā)病因素與遺傳和環(huán)境密切相關(guān)，因此構(gòu)建一個與人類基因相似的非人靈長類動物糖尿病模型，對糖尿病的發(fā)病機(jī)理、預(yù)防、診斷和治療的研究評價至關(guān)重要。

徐傳磊等[19]采用雄性食蟹猴8只，隨機(jī)分成正常組和模型組，采用一次性靜脈注射45 mg·kg-1鏈脲佐菌素造模，正常組一次性靜脈注射45 mg·kg-1檸檬酸緩沖液；結(jié)果經(jīng)造模后，模型組出現(xiàn)了糖尿病的典型癥狀：攝食量、飲水量、尿量顯著增多，體質(zhì)量顯著下降；C肽含量顯著下降；造模后第2周空腹血糖升高，尿糖由陰性變?yōu)椤?+++”；第5周出現(xiàn)糖耐量異常，第7周空腹血糖與正常組有顯著性差異，GAD-Ab陽性；胰腺組織病理檢查結(jié)果顯示模型組胰島萎縮、纖維化，正常組無變化。提示成功建立1型糖尿病食蟹猴模型。

2型糖尿病作為與基因密切相關(guān)的高發(fā)性代謝疾病嚴(yán)重威脅中老年人的生活質(zhì)量[20]。季芳等[21]將19只食蟹猴分為3組，應(yīng)用熒光定量PCR檢測技術(shù)對健康對照組、自發(fā)性組和高脂飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生的食蟹猴2型糖尿病模型組外周白細(xì)胞中的36個糖尿病相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示與對照組相比，糖尿病組的G6PD、G6PC、ACLY等19個基因表達(dá)量變化顯著(P<0.05),且自發(fā)組和誘導(dǎo)組對比大部分基因表達(dá)量差異不顯著，由此證明自發(fā)性和誘發(fā)性食蟹猴2型糖尿病模型都可以作為糖尿病研究的理想的動物模型。張艷春等[22]采用36只9～20歲偏胖中老年雄性食蟹猴，隨機(jī)分成對照組、高糖組、高脂組、高脂高糖組，每6個月測一次坐高和體重，并采集尿液和血液，并檢測指標(biāo)。結(jié)果顯示，高能量膳食組的血糖、血脂水平與造模前相比，都有顯著升高。根據(jù)結(jié)果可知道，不同膳食成分的高能量膳食均能誘發(fā)食蟹猴2型糖尿病，該模型是模擬自發(fā)型糖尿病發(fā)病機(jī)理構(gòu)建的較理想2型糖尿病動物模型。

5 展望

長期以來臨床前研究多采用小鼠、大鼠、兔子、狗等嚙齒類動物建立病理模型進(jìn)行疾病機(jī)制研究和藥效研究。雖然這些動物模型易得、且價格低廉，但是其生理結(jié)構(gòu)、遺傳基因等與人類存在很大差異，這就導(dǎo)致研究數(shù)據(jù)在用于臨床人體上時存在一定偏差。食蟹猴作為非人靈長類動物，在遺傳基因、生理和組織結(jié)構(gòu)、免疫代謝等與人類極為相似[23-24]，其與人類的遺傳同源性達(dá)到92.5%～95%，屬于NHP動物[25]。利用食蟹猴建立人類疾病模型進(jìn)行相關(guān)研究會更加有利地將實驗成果轉(zhuǎn)化到臨床上應(yīng)用。而且與嚙齒類動物相比，食蟹猴性格溫順、生命周期更長，能充分觀察和研究動物的代謝異常情況和肝腎、肺部等組織病理學(xué)改變，更有利于其在毒理學(xué)和慢性病模型中的應(yīng)用。目前食蟹猴國內(nèi)資源稀缺，主要靠從東南亞國家進(jìn)口，價格相對昂貴。近年來國內(nèi)食蟹猴養(yǎng)殖也在逐漸起步，慢慢規(guī)范化，具有很好的發(fā)展趨勢，相信不久將來食蟹猴動物模型將成為醫(yī)藥行業(yè)科研工作者最佳選擇。