鹽酸西替利嗪片人體生物等效性試驗(yàn)

司鴿，郭建艷，張紅貞，高娟，鄭忠輝

(1.淄博職業(yè)學(xué)院，山東 淄博 255314；2.山東新華制藥股份有限公司，山東 淄博 255035；3.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，山東 淄博 255011)

鹽酸西替利嗪片為口服劑型的H1受體拮抗劑，為抗過(guò)敏類非處方藥，適應(yīng)證為季節(jié)性鼻炎、常年性過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎及過(guò)敏引起的瘙癢及蕁麻疹的對(duì)癥治療。美國(guó)應(yīng)變性鼻炎診療指南(2015)推薦西替利嗪為治療變應(yīng)性鼻炎及非變應(yīng)性鼻炎的一線口服抗組胺藥物[1-6]。鑒于鹽酸西替利嗪片的臨床作用，為增加臨床醫(yī)生和患者的用藥選擇，根據(jù)《國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于開(kāi)展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見(jiàn)》(國(guó)辦發(fā)〔2016〕8號(hào))要求，本研究選用新華制藥(高密)有限公司生產(chǎn)的鹽酸西替利嗪片為受試者制劑，UCB Farchim SA(瑞士)原研鹽酸西替利嗪片為參比制劑[7-8]，開(kāi)展人體生物等效性臨床試驗(yàn)。

1 藥品、試劑和儀器

鹽酸西替利嗪片受試制劑[T，規(guī)格：10 mg /片，新華制藥(高密)有限公司，批號(hào)：1703001]；鹽酸西替利嗪片參比制劑[R，規(guī)格：10 mg/片，UCB Farchim SA(瑞士)，批號(hào)：170664]。對(duì)照品：鹽酸西替利嗪[新華制藥(高密)有限公司，批號(hào)：160611，純度/含量：99.6%(按干燥品計(jì))]。內(nèi)標(biāo)：鹽酸氘代西替利嗪[(±)-Cetirizine-d4-Dihydrochloride)，Toronto Research Chemicals，批號(hào)：24-GHZ-126-1，純度/含量：98%]。甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，Merck公司生產(chǎn)；超純水為自制品；其他試劑均為分析純。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)系統(tǒng)：UFLC20-AD超快速液相系統(tǒng)(島津公司)；AB Sciex Triple QuadTMAB SCIEX 5500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；色譜柱：Luna 5 μm HPLC 200A 100×2 mm，批號(hào)：H16-099554、H16-327417；數(shù)據(jù)采集/管理軟件為AnalystTM軟件1.6.2版、Thermo Watson 7.5實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 受試者 本試驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，空腹和餐后共篩選128例受試者，年齡18～45歲，體重指數(shù)18.0～26.0 kg·(m2)-1，所有受試者均在充分了解本試驗(yàn)的目的、方法及風(fēng)險(xiǎn)后，自愿簽署知情同意書(shū)，統(tǒng)一進(jìn)行查體和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，經(jīng)篩選合格并隨機(jī)納入空腹試驗(yàn)的受試者24例，餐后試驗(yàn)的受試者24例。

完成例數(shù)：空腹試驗(yàn)完成24例，無(wú)脫落/剔除；餐后試驗(yàn)完成22例，2名受試者因首個(gè)血藥濃度值為Cmax，未納入藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)集(PKPS)及生物等效性集(BES)。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8-11]本試驗(yàn)采用隨機(jī)、開(kāi)放、單劑量、自身交叉設(shè)計(jì)，分空腹和餐后兩個(gè)研究進(jìn)行，各入組24例受試者，男女兼有。試驗(yàn)每周期給藥1次，給藥劑量為10 mg，健康受試者隨機(jī)分為兩組，每組人數(shù)相等，清洗期為5 d。

受試者于給藥前一天入住研究中心，分配隨機(jī)號(hào)，晚上統(tǒng)一進(jìn)清淡飲食，然后禁食至少10 h。受試者于給藥前1 h內(nèi)于前臂放置靜脈留置針。

空腹試驗(yàn)：受試者于試驗(yàn)當(dāng)天上午空腹隨機(jī)接受單劑量口服給藥，240 mL水送服，給藥后4 h內(nèi)禁食，給藥前后1 h內(nèi)禁水。受試者分別于給藥前1 h內(nèi)(作為0 h)及用藥后0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.33、1.67、2、3、5、8、12、24、48 h采集血樣4 mL，共計(jì)15個(gè)采血點(diǎn)。

餐后試驗(yàn)：受試者于試驗(yàn)當(dāng)天上午給藥前30 min時(shí)進(jìn)食試驗(yàn)餐，30 min內(nèi)用餐完畢，在開(kāi)始進(jìn)餐后30 min時(shí)準(zhǔn)時(shí)接受單劑量口服給藥，給藥后4 h進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)午餐。受試者分別于給藥前1 h內(nèi)(作為0 h)及用藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、8、12、24、48 h采集血樣4 mL，共計(jì)14個(gè)采血點(diǎn)。

樣品采集與處理[11]：每次個(gè)采血點(diǎn)所有受試者血樣于采集完畢后60 min內(nèi)置低溫離心機(jī)內(nèi)，在2～8 ℃、1 500～2 000 ×g(2 500～3 000 r·min-1)下離心10 min，分離獲得血漿分裝為2管，其中1管為測(cè)試管，1份為備份管，2 h內(nèi)放置低溫冰箱(-20 ℃)中。所有樣品采集并處理后放置臨床研究單位低溫冰箱(約-70 ℃)中暫存，直至樣品轉(zhuǎn)運(yùn)。

所有測(cè)試樣本分析完成后轉(zhuǎn)移至低溫冰箱(約-20 ℃)長(zhǎng)期保存。

2.3 血漿樣品的處理與測(cè)定 取樣品，待其完全融化后，混勻約30 s，移取50 μL樣品(空白樣品和內(nèi)標(biāo)空白樣品加50 μL的空白人血漿)至96孔板中，隨后分別加10 μL的IS-W溶液[空白樣品加入10 μL甲醇∶水(1∶1)]，渦旋均勻，之后再加入0.5 mL乙腈，渦旋3 min，3 200×g、4 ℃條件下離心5 min，最后，取200 μL上清液至新的96孔板中，40 ℃氮?dú)饬鞔蹈?，吹干后加?00 μL復(fù)溶液，渦旋3 min，提交LC-MS/MS分析。

2.4 LC-MS/MS條件 色譜條件：Luna 5 μm HPLC 200A 100×2 mm色譜柱；流動(dòng)相為乙腈：0.4%甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH至3.2)，95∶5等度洗脫；流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃；運(yùn)行時(shí)間3.0 min。

質(zhì)譜條件：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的API 5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；離子化方式為(+)ESI；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；質(zhì)譜參數(shù)：離子源噴霧電壓(IS)5 000 V，氣簾氣(SUR)20 psi，離子源溫度(TEM)500 ℃，入口電壓(EP)10 V，碰撞氣(CAD)6 unit，出口電壓(CXP)15 V，停留時(shí)間(Dwell)100 ms，離子源氣體1為50 psi，離子源氣體2為50 psi，用于定量的離子反應(yīng)分別為m/z 389.2→201.1(西替利嗪)和m/z 393.2→201.1(西替利嗪-d4)。

3 分析方法驗(yàn)證[12]

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍 配置質(zhì)量濃度為50.0、100、250、1 250、2 500、12 500、22 500和25 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，按“2.3”項(xiàng)下操作：以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(1/X2)進(jìn)行回歸運(yùn)算，得直線回歸方程為Y=0.024 5X+0.001 4，R2=0.998 8(見(jiàn)圖1)。結(jié)果顯示鹽酸西替利嗪的線性范圍為1.00～500 ng·mL-1，定量下限為1.00 ng·mL-1。

圖1 人血漿中待測(cè)物的典型校正曲線

3.2 準(zhǔn)確度和精密度 考察3個(gè)分析批次的質(zhì)控(QC)樣品，每批次各考察低(QCL)、中(QCM)、高(QCH)3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品各6份，結(jié)果如表1顯示批內(nèi)及批間RE均在±15%之內(nèi)且滿足CV≤15%。

表1 準(zhǔn)確度和精密度

3.3 選擇性 分別考察6批基質(zhì)的不含內(nèi)標(biāo)/含內(nèi)標(biāo)空白血漿樣品，結(jié)果如表2顯示批基質(zhì)對(duì)分析物測(cè)定的干擾為0.00，均小于20%分析物定量下限，同時(shí)對(duì)內(nèi)標(biāo)測(cè)定的干擾為0.00，均小于5%內(nèi)標(biāo)峰面積均值?？疾?份只含內(nèi)標(biāo)的混合血漿樣品，對(duì)分析物測(cè)定的干擾為0.00，小于20%分析物定量下限?？疾旌可舷薜幕旌涎獫{樣品，對(duì)內(nèi)標(biāo)測(cè)定的干擾為0.00，小于5%內(nèi)標(biāo)峰面積均值。

表2 選擇性

3.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 提取回收率考察低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6份樣品，對(duì)比混合基質(zhì)提取后添加的質(zhì)控樣品與相應(yīng)質(zhì)控純?nèi)芤簶悠?，結(jié)果如表3顯示待測(cè)物3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品平均回收率分別為81.24%、101.82%、93.90%，總體回收率為92.32%，總體變異%CV為11.27；內(nèi)標(biāo)3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品平均回收率分別為87.95%、108.28%、97.70%，總體回收率為97.98%，總體變異%CV為10.41。

表3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)考察6批基質(zhì)高、低2個(gè)濃度點(diǎn)的基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)比提取后添加的質(zhì)控樣品與相應(yīng)質(zhì)控純?nèi)芤簶悠?，?jì)算基質(zhì)因子和內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子，結(jié)果顯示待測(cè)物基質(zhì)效應(yīng)因子、內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)因子、內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子的%CV均小于15%。

3.5 穩(wěn)定性 分別考察待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液和工作溶液在室溫條件下的短期穩(wěn)定性及冷凍條件下長(zhǎng)期穩(wěn)定性，結(jié)果顯示待測(cè)物室溫放置22 h穩(wěn)定，內(nèi)標(biāo)工作液室溫放置19 h穩(wěn)定，內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液室溫放置17 h穩(wěn)定；待測(cè)物儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)工作液在低溫冰箱(約-20 ℃或-70 ℃)儲(chǔ)存55 d穩(wěn)定。

4 數(shù)據(jù)處理與生物等效性分析[8,10]

4.1 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 用于評(píng)價(jià)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)包括：Cmax、AUC0～t、AUC0～∞、Tmax、t1/2、λZ。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算由WinNonlin8.0版本完成，方差分析、等效性結(jié)果分析、人口學(xué)與安全性數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.4版本軟件分析。受試者單次空腹或餐后口服鹽酸西替利嗪片受試制劑和參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表4和表5所示。

表4 受試者單次空腹口服鹽酸西替利嗪片T、R的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表5 受試者單次餐后口服鹽酸西替利嗪片T、R的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

4.2 等效性判斷 采用西替利嗪的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。

藥物經(jīng)時(shí)濃度數(shù)據(jù)采用實(shí)測(cè)值進(jìn)行描述。將受試制劑與參比制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～t、AUC0～∞經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行多因素方差分析在α=0.05水平上進(jìn)行雙向單側(cè)t檢驗(yàn)，對(duì)Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Cmax、AUC0～t、AUC0～∞幾何均值比的90%的置信區(qū)間，按照不低于80.00%，不高于125.00%，對(duì)兩種制劑空腹和餐后的生物等效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

5 結(jié)果

空腹BE試驗(yàn)：24名健康受試者分別單次空腹服用受試制劑和參比制劑10 mg后，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞幾何均數(shù)的比值分別為100.18%、96.37%、96.00%，其90%置信區(qū)間分別為95.72%～14.84%、92.37%～100.55%、91.77%～100.42%，均落在等效區(qū)間80.00%～125.00%之間，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表6，平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 24名受試者分別空腹口服T、R后西替利嗪的平均藥時(shí)曲線

表6 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(空腹)

餐后BE試驗(yàn)：22名健康受試者分別單次餐后服用受試制劑和參比制劑10 mg后，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞幾何均數(shù)的比值分別為103.98%、102.19%、101.58%，其90%置信區(qū)間分別為98.31%～109.97%、98.33%～106.20%、98.07%～105.20%，均落在等效區(qū)間80.00%～125.00%之間，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表7，平均藥時(shí)曲線見(jiàn)圖3。

表7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(餐后)

圖3 22名受試者分別餐后口服T、R后西替利嗪的平均藥時(shí)曲線

6 結(jié)論

研究表明，健康受試者空腹和餐后條件下單劑量服用鹽酸西替利嗪片受試制劑與參比制劑在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC、Tmax、t1/2、Tmax均無(wú)顯著性差異，兩制劑具有生物等效性。

健康受試者單次空腹和餐后服用鹽酸西替利嗪片受試制劑與參比制劑的安全性一致且較好