HPLC法測定斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量

林凡友，孫永喜，陳仁燕

(翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023)

斷血流是一種民間傳統(tǒng)用藥，含有多種化學(xué)成分，具有止血、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎等藥理作用，臨床上主要應(yīng)用于治療各種出血癥[1-2]。斷血流口服液是由斷血流藥材經(jīng)提取濃縮等工藝制成的口服液，具有涼血止血的功效。適用于血熱妄行的出血證候，用于功能性子宮出血，產(chǎn)后出血，子宮肌瘤出血，單純性紫癜，原發(fā)性血小板減少性紫癜系血熱妄行者[3]。目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS-546(X-079)-2000-2016Z)，其中斷血流口服液含量檢測方法為薄層掃描法，目前廣泛用于測定斷血流皂苷含量的方法有高效液相色譜法[4-5]、紫外分光光度計法[6]，為提高斷血流口服液含量檢測的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)制定了高效液相色譜(HPLC)法檢測斷血流口服液中的斷血流皂苷A，并對該含量測定方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。試驗(yàn)表明，該方法簡單，可以有效地檢測斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量，準(zhǔn)確地控制制劑有效成分，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(紫外檢測器，型號：G1314F，美國安捷倫公司)；AUW220D型電子天平。斷血流皂苷A對照品(批號：110782-200602)來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，來源于美國天地有限公司；水為純化水；其他試劑均為分析純。斷血流口服液樣品來源于翔宇藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(75∶25)，檢測波長250 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按斷血流皂苷A峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取斷血流口服液適量(批號：200401)，精密量取本品1 mL，加水24 mL，搖勻，置分液漏斗中，加水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液30 mL洗滌，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，取正丁醇蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 稱取五氧化二磷減壓干燥器內(nèi)干燥12 h的斷血流皂苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含500 μg的溶液，即得對照品貯備溶液，精密吸取對照品貯備液適量，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液制備 取不含斷血流藥材的陰性樣品適量，同供試品溶液制備處理方法，配制成陰性供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各20 μL，用高效液相色譜儀測定，如圖1。在該色譜條件下陰性樣品對樣品峰沒有干擾；主峰保留時間在20 min左右，理論板數(shù)按斷血流皂苷A峰計算大于3 000，說明該方法專屬性良好。

圖1 斷血流口服液專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

2.4 線性試驗(yàn) 精密吸取對照品儲備液適量分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋制成濃度分別為2.21、6.63、8.84、11.05、16.58、22.1 μg·mL-1的溶液，分別作為20%、60%、80%、100%、150%、200%的線性溶液，依法測定斷血流皂苷A的含量。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由試驗(yàn)結(jié)果可知，斷血流皂苷A含量在2.21～22.1 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，線性方程為Y=32.493X+1.241 3，r=0.999 9(n=6)，峰面積和濃度均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 斷血流皂苷A含量測定線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 系統(tǒng)精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，重復(fù)測6次，并記錄色譜圖。結(jié)果表明：峰面積的RSD值為0.27%，表明該方法的系統(tǒng)精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取一批樣品6份，按供試品制備方法制備供試品溶液，依法測定，計算含量為0.816 mg·mL-1，含量RSD為1.83%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液于室溫條件下放置12 h，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h測定。結(jié)果表明，在室溫條件下放置12 h內(nèi)，測得供試品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取斷血流口服液樣品(批號：200401，斷血流皂苷A含量為0.816 mg·mL-1)適量，每個容量瓶中分別精密加入0.5 mL，共9份，分別加入適量對照品溶液與供試品中待測成分含量之比為0.5∶1、1∶1、1.5∶1，依法測定，如表1。由試驗(yàn)結(jié)果可知，含量測定各濃度下回收率在98.49%～101.51%范圍內(nèi)，平均值為99.66%，RSD為1.12%，表明該方法回收率良好。

表1 斷血流口服液含量測定回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 耐用性試驗(yàn) 分別考察了標(biāo)準(zhǔn)色譜條件及柱溫(20、30 ℃)、流速(0.9、1.1 mL·min-1)、 流動相比例(73∶27～77∶23)、不同品牌柱子(迪瓦、月旭、熱電)條件下，分別測定含量。結(jié)果表明，在柱溫、色譜柱、流動相比例及流速等變動因素有微小變化

時，斷血流皂苷A含量RSD為1.13%，斷血流皂苷A含量測定試驗(yàn)結(jié)果均基本沒有變化，表明該方法的耐用性良好。

2.10 樣品含量測定 取3批斷血流口服液，依法測定斷血流皂苷A含量，結(jié)果如表2所示。

表2 斷血流口服液樣品中斷血流皂苷A含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動相考察 考察了流動相甲醇-水(71∶29)[7]、甲醇-水(75∶25)[8-9]、甲醇-0.5%磷酸(75∶25)[10]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，流動相為甲醇-0.5%磷酸(75∶25)時，在峰前有個小鼓包且基線不平，流動相為甲醇-水(71∶29)時，斷血流皂苷A含量較流動相為甲醇-水(75∶25)時低，流動相為甲醇-水(75∶25)時斷血流皂苷A峰對稱性好，基線平，雜峰少，能準(zhǔn)確檢測斷血流皂苷A色譜峰。

3.2 波長的選擇 通過對斷血流皂苷A對照品溶液的紫外吸收全波長掃描，確定在250 nm處，斷血流皂苷A有最大吸收，故選用250 nm作為高效液相色譜檢測波長。

斷血流口服液是純中藥制劑，安全有效、副作用小，其所含成分復(fù)雜，經(jīng)藥理和臨床試驗(yàn)證明，其皂苷類成分對于止血具有治療出血的作用，因此選擇檢測斷血流皂苷A來控制斷血流口服液有效成分及樣品質(zhì)量[11]。本文采用高效液相色譜法測定斷血流口服液中的斷血流皂苷A的含量，操作簡單，含量準(zhǔn)確，靈敏度高，耐用性強(qiáng)，能準(zhǔn)確控制藥物的質(zhì)量，可以作為檢測斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量。