脂肪來源干細胞(ADSC)在脂肪移植中的應用

李云竹 楊伊蘭 梁錚韻 龍 笑

自體脂肪移植的臨床應用廣泛，包括面部年輕化、瘢痕疙瘩、傷口愈合、軟組織再造等方面。除了取材方便、性價比高、不具有異體材料的免疫排斥反應等一系列優(yōu)點，自體脂肪移植還能與抽脂術(shù)同期進行，在達到理想的治療效果的同時，又額外起到了塑型瘦身的效果。但是同時，移植脂肪的存活率具有很大的不確定性，據(jù)目前的研究報道，脂肪移植的一年期存活率為20%～80%[1,2]。

供區(qū)和受區(qū)的部位以及脂肪的獲取、處理和注射過程中所使用的方法的多樣性都會極大程度影響脂肪的存活率[3]。除了在傳統(tǒng)的操作過程中尋求方法，細胞輔助脂肪移植(cell-assisted lipotransfer, CAL)也能極大程度地提高脂肪細胞的存活率[4]。脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cell, ADSC)和脂肪血管基質(zhì)組分(stromal vascular fraction, SVF)是目前最常用到的成分。

一、ADSC和SVF概述

2001年Zuk等[5]在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)一類具有多能分化能力的干細胞，并將之命名為ADSC。與骨髓干細胞類似，ADSC可以分化成脂肪、軟骨、肌肉和骨骼。更重要的是，ADSC還參與血管生成、免疫調(diào)節(jié)和組織再生的旁分泌信號轉(zhuǎn)導的過程。而SVF是脂肪組織分離得到ADSC的過程中的中間產(chǎn)物。它是一個混合細胞群，其中除了2%～10%的ADSC外，還包含造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、紅細胞等細胞組分及細胞外基質(zhì)。

二、SVF和ADSC的制備方法

1.提?。禾崛VF的方法眾多，但目前還沒有比較各種方法療效的數(shù)據(jù)，尚無標準制備流程的文獻發(fā)表?？偟膩碚f提取方法主要分為酶消化法和機械乳化法。酶消化法是使用膠原酶消化抽吸得到的脂肪，破壞掉細胞外基質(zhì)后，通過離心、過濾或靜置這3種方法都可以分離得到位于下層的SVF[6,7]。酶分解法的問題在于其產(chǎn)量小、耗時，并且膠原酶可能殘留的毒性都使得酶分解法無法在臨床環(huán)境中很好地發(fā)揮作用。

Tonnard等[8]在2013年提出了機械乳化法，他們將抽脂得到的脂肪經(jīng)注射器快速對打30次以后破壞掉了成熟的脂肪細胞，再通過乳化液過濾以后制得納米脂肪(nanofat)。這種納米脂肪實際上并沒有脂肪組織，而是由大量的ADSC組成。除此以外，Raposio等[9]隨后又提出一種依靠快速振動和離心得到SVF的方法。這兩種方法與消化酶法比較便捷許多，但是也有研究指出相比于酶法，這兩種機械法得到的SVF中的ADSC的數(shù)目要少10～20倍[10]。

傳統(tǒng)的SVF提取方法并不能滿足市場需求，為了更高效地提取SVF，各式各樣的自動化提取儀器相繼出現(xiàn)。目前大約有30種自動化和半自動化儀器處在開發(fā)中，他們的基本原理都是酶分解法或機械法[11]。

2.ADSC的分離、培養(yǎng)與擴增：因為SVF是一個混合細胞群，因此還需要對提取到的SVF進行分離才能得到純凈的ADSC。ADSC具有貼壁性，可以利用這一點對ADSC進行分離。最常用的方法是在添加10%胎牛血清的標準培養(yǎng)基中進行單層培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)基。當達到亞融合時，采集黏附細胞，在PBS中洗滌，計數(shù)并分析其生長情況、克隆性和抗原表達[12]。從200ml抽吸得到的脂肪中可獲得(1～10)億個有核細胞，其中至少10%是ADSC[13]。如果抽吸得到的脂肪量很多，那么分離后的細胞就可以直接用于科研或臨床實驗。相反，還需要進行體外擴增才能獲得足夠的ADSC。ADSC的分離和擴增較為簡單，但細胞壽命較短，且在體外傳代后，ADSC的生長能力也顯著降低，這不僅限制了它們在臨床前的研究，也限制了它們治療潛力的全面評估。

三、ADSC在脂肪移植中的應用

1.作用原理:移植的脂肪的存活原理，目前的主流觀點仍然是Peer[14]在20世紀50年代提出的“細胞存活理論”。他們認為移植的脂肪組織確實能夠存活，其機制是移植脂肪和受區(qū)的血管發(fā)生早期吻合并建立血液循環(huán)。后來的研究又進一步深化了這個觀點，并衍生出了“宿主替代理論”，在脂肪移植后的最初一段時間內(nèi)，脂肪組織嚴重缺血，所有的脂肪細胞都經(jīng)歷了退行性變和適應性組織重塑。這兩種變化的孰強孰弱決定了最終脂肪組織的存活率[15]。Matsumoto等[16]率先把ADSC運用在小鼠脂肪移植上，發(fā)展出了細胞輔助脂肪移植術(shù)(CAL)。他們發(fā)現(xiàn)抽吸得到的脂肪中的ADSC數(shù)量遠遠少于完整切除的脂肪，并且血管結(jié)構(gòu)的數(shù)量比較之下也很稀少。其實驗結(jié)果顯示CAL 組的移植脂肪的平均成活率比對照組高出35%。

目前關(guān)于ADSC在脂肪移植中的作用原理主要包括以下4個方面[17～19]：(1)ADSC可以幫助宿主ADSC分化為成熟的脂肪細胞，增加脂肪細胞的數(shù)量。(2)ADSC還可以分化成血管內(nèi)皮細胞甚至血管壁細胞，為移植脂肪提供血供。(3)ADSC能夠釋放大量的血管內(nèi)皮因子，促進血管生成，改善血供，減少壞死。(4)即使在嚴重缺血的狀態(tài)下，ADSC都能夠以干細胞的狀態(tài)持續(xù)存在。在脂肪組織中，脂肪細胞的轉(zhuǎn)化由ADSC介導，其過程非常緩慢，通常經(jīng)歷兩年甚至更長的時間。然而脂肪移植的一系列操作過程給脂肪細胞造成了暫時性缺血再灌注損傷，這使得脂肪細胞在術(shù)后2～3個月就發(fā)生轉(zhuǎn)化。然而在抽吸獲取的脂肪中，相對缺乏的ADSC不足以支持整個轉(zhuǎn)化過程，導致術(shù)后半年左右發(fā)生脂肪萎縮。相反，CAL中足夠的ADSC則可以支持術(shù)后發(fā)生的脂肪轉(zhuǎn)化，避免了脂肪萎縮的發(fā)生[19]。Qiu等[20]發(fā)現(xiàn)移植脂肪的最外層有棕色脂肪的出現(xiàn)，提示移植脂肪的ADSC分化成棕色脂肪的可能性。這一研究結(jié)果補充說明了ADSC在脂肪移植中，不僅可以幫助宿主ADSC分化為成熟的脂肪細胞，增加脂肪細胞的數(shù)量，甚至可以直接分化為脂肪細胞，優(yōu)化脂肪移植的效果。

2.臨床應用：CAL技術(shù)最早在2008年由Yoshimura等[21]完成并報道。他們對40例女性實施了CAL隆乳術(shù)，術(shù)后兩個月的脂肪保留率仍然令人滿意。自此，CAL在過去10年成為了整形外科臨床研究的熱點之一。不過，值得注意的是，并非所有的臨床試驗都取得了良好的效果。也有研究報道與傳統(tǒng)的脂肪移植術(shù)比較，CAL的脂肪存活率差異無統(tǒng)計學意義(54% vs 50%)[22]。Laloze等[23]在2017年對24篇相關(guān)文獻進行了Meta分析，其研究結(jié)果顯示與傳統(tǒng)脂肪移植術(shù)比較，CAL的脂肪存活率確實是增高的(64% vs 44%,P=0.000)，然而這個優(yōu)勢僅在脂肪移植量<100ml的時候才會體現(xiàn)出來(P=0.03)。另一篇Meta分析的亞組分析結(jié)果提示，雖然面部CAL的脂肪存活率顯著高于傳統(tǒng)脂肪移植術(shù)(P=0.041)，但是胸部的脂肪存活率在CAL組和非CAL組之間比較差異無統(tǒng)計學意義[24]。除了面部更為豐富的血管更有利于移植脂肪的存活以外，胸部手術(shù)需要的更大量的移植脂肪所伴隨的延長的手術(shù)時間也可能會影響結(jié)果。Sasaki[25]研究發(fā)現(xiàn)脂肪離體后1h的脂肪存活率為90%，然而6～8h這一數(shù)值就會減少為10%。

當脂肪移植的數(shù)量較少，手術(shù)時間較短的時候，CAL對細胞存活的正面影響更明顯，使得CAL中脂肪存活率更高。反之，當脂肪移植的數(shù)量更大，操作的難度更高，手術(shù)時間更長的時候，CAL對細胞存活的負面影響就會超過其正面影響，得到相反的結(jié)果。由此可見，CAL在面部年輕化等微整形手術(shù)中可能會發(fā)揮更好的作用。需要多少細胞才能使移植脂肪的存活率最高，以及分離得到ADSC或者SVF需要用到多少脂肪, 目前還沒有一致的意見。并不是ADSC或SVF越多，脂肪細胞的存活率就越高。盡管ADSC或者SVF可能有助于脂肪細胞存活，但這些細胞本身也會和脂肪細胞競爭營養(yǎng)物質(zhì)，因此想要達到最佳的效果，需要在ADSC/SVF和脂肪細胞之間尋找平衡。有小鼠實驗顯示，在50000個SVF細胞/毫升脂肪的濃度下，脂肪存活率是最高的[26]。同時也有臨床實驗顯示當移植脂肪量比較大(30ml)時，ADSC的濃度達到2000萬個/毫升時也能取得較好的效果，術(shù)后3個月的脂肪存活率可以達到76.7%[27]。最佳濃度與許多因素有關(guān)。筆者推斷其可能原因為，當移植脂肪量在一定范圍內(nèi)時，ADSC/SVF的最佳濃度與其呈正相關(guān)，即每一特定的脂肪移植量都有與之對應的最佳濃度，并且移植量越高，最佳濃度也越高。但是當脂肪移植量超過某一范圍，即使增加ADSC/SVF的濃度，也不會改善移植的效果。還有一點需要注意的是，SVF由高度異質(zhì)性的細胞群組成，它不光包含了ADSC，還有其他細胞，并且SVF中所含ADSC的比例以及活性也會受患者年齡、制備方式等多種因素影響[28]。

四、安全性

1.免疫方面：雖然有研究指出ADSC具有免疫抑制性，但是異體ADSC使用的安全性仍然令人擔憂。雖然有研究顯示接受異體ADSC治療后，患者的CD4/CD8、細胞因子水平和非特異性IgM和IgG均未顯示對外來細胞發(fā)生任何免疫反應的跡象[29]。但同時也有兩項研究測試供體特異性抗體，結(jié)果顯示19%～34%的患者產(chǎn)生了這些抗體。這表明ADSC并不像人們想象的那樣具有免疫豁免權(quán)。雖然以上的研究并非是CAL，但是研究的結(jié)果也應當引起注意。

2.腫瘤方面：對于ADSC的安全性最大的擔憂是其致癌性。細胞實驗和動物實驗都已經(jīng)證實ADSC不僅可以加速腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，還能增加腫瘤復發(fā)的風險。最新研究發(fā)現(xiàn)，雖然ADSC可以促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但是含有相同ADSC數(shù)量的CAL卻并不具備這種特性。研究者給出的解釋是脂肪細胞可能對ADSC產(chǎn)生旁分泌影響，導致它們優(yōu)先生成脂肪，而不是生成血管[30]。Pérez-Cano等[31]利用CAL對67例乳腺癌術(shù)后的患者進行乳房重建術(shù)并隨訪1年。在隨訪期內(nèi)，沒有患者出現(xiàn)疾病復發(fā)。Gotoh等[32]將CAL運用在了對尿失禁的治療上。接受治療的患者中有9例有前列腺癌病史。這9例患者在治療后1年的隨訪期內(nèi)沒有出現(xiàn)疾病復發(fā)。盡管截至目前，臨床實驗的結(jié)果都是相對令人滿意的，但是相對較短的隨訪期仍然無法證實ADSC的遠期安全性。對于有腫瘤病史的患者，CAL的使用需要格外謹慎。

五、法律、法規(guī)

目前尚沒有關(guān)于規(guī)范化使用ADSC的統(tǒng)一標準，有關(guān)人類細胞治療中ADSC的臨床文獻也存在不足，即文獻中大多涉及基礎研究和(或)臨床治療以外的其他應用。然而“脂肪干細胞治療”這個概念所帶來的巨大商業(yè)潛能使之成為醫(yī)美領(lǐng)域的熱點。為了規(guī)范市場操作，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于2014年出臺了一系列操作規(guī)范草案。首先，根據(jù)整個操作流程，脂肪干細胞治療被分為低危和高危兩個級別并分別對應不同嚴格程度的法規(guī)。低危組需要滿足：(1)對人體細胞、組織或相關(guān)產(chǎn)品進行最低限度的操作。(2)人類細胞、組織或相關(guān)產(chǎn)品僅同源使用。(3)人體細胞、組織或細胞和組織產(chǎn)品的制造不含有其他物質(zhì)。(4)人體細胞、組織或細胞及組織產(chǎn)品不具有系統(tǒng)性效應，且其主要功能不依賴于活細胞的代謝活性。在這種情況下，F(xiàn)DA允許ADSC在沒有特定審批流程的情況下，作為一種試驗性新藥，在臨床實驗中使用。如果ADSC的制備過程中具有超過最低限度的操作，如體外擴增或者與非組織成分結(jié)合，那么這樣的人體細胞、組織或相關(guān)產(chǎn)品會被視為藥物或生物產(chǎn)品，并受美國《公共衛(wèi)生系統(tǒng)法》第351節(jié)的管制。因此，在較高的風險水平下，引入ADSC或?qū)⑵渥鳛樗幬?，發(fā)起人需要作出相關(guān)申請，只有在證明產(chǎn)品預期用途安全有效后，此類產(chǎn)品才能用作臨床使用。在歐洲，如果ADSC是自體來源，由機械分離法制備得到，并且僅用作皮下使用，那么這樣的ADSC就可以被用在臨床治療中。然而具體到ADSC在脂肪移植的應用上面，目前并沒有任何已知的專門的法律法規(guī)。我國已陸續(xù)出臺《干細胞臨床實驗研究管理辦法》、《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究技術(shù)指導原則》等有關(guān)規(guī)定，有關(guān)ADSC的臨床實驗仍然需要按規(guī)范進行[33,34]。

六、展 望

憑借其多功能分化能力，ADSC可以用于協(xié)助脂肪移植，顯著提高脂肪存活率，并具有良好的再生醫(yī)學方面的潛力。但是，ADSC本身所具備的潛在致癌性，以及制備過程中存在的挑戰(zhàn)都限制了其廣泛臨床應用的開展。尋求在短時間內(nèi)大量制備ADSC的可行方法以及ADSC與移植脂肪的最佳配比將會對ADSC的臨床應用起到極大的推進作用。與此同時，嚴格按照相關(guān)法律規(guī)定進行臨床操作，不侵害患者的權(quán)益，將是ADSC未來應用中重要的原則。