腦白質(zhì)缺血性損傷與再生的體外模型研究進(jìn)展

邱 楊 張 菁

少突膠質(zhì)細(xì)胞是大腦白質(zhì)中最為重要的膠質(zhì)細(xì)胞，它們包繞神經(jīng)元軸突形成髓鞘，為軸突的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持，同時(shí)由于髓鞘的絕緣作用使得神經(jīng)元電信號(hào)的傳播更為迅速[1]。少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于諸如腦缺血導(dǎo)致的興奮性氨基酸以及氧化應(yīng)激十分敏感，急性腦缺血或長(zhǎng)期低灌注狀態(tài)都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的白質(zhì)損傷[2]。作為補(bǔ)償效應(yīng)，損傷周圍或者新生細(xì)胞聚集的腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)中的OPCs可以增殖、遷移到損傷部位，重新分化成熟，最后形成新的髓鞘[3, 4]。然而，構(gòu)建腦白質(zhì)缺血性損傷與再生的動(dòng)物模型難度較大，模型的影響因素也較為復(fù)雜，且構(gòu)建如慢性低灌注損傷模型費(fèi)時(shí)久。而作為條件更為可控的體外模型，建模難度小、費(fèi)時(shí)短，因此能較快篩選出有前景的藥物。本文旨在對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷與再生的體外模型的建立方法以及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)有所幫助。

一、OPCs體外缺血模型

1.少突膠質(zhì)細(xì)胞體外活力或功能試驗(yàn):腦缺血或者長(zhǎng)期低灌注損傷會(huì)造成過谷氨酸過度釋放導(dǎo)致的興奮性毒性、組織血氧下降以及營(yíng)養(yǎng)因子下降。為了模擬這些損傷，體外模型中有谷氨酸興奮性毒性損傷(培養(yǎng)液中添加谷氨酸 24h)、饑餓(去除原培養(yǎng)液中OPCs生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)因子)、糖氧剝奪實(shí)驗(yàn)(將細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱且細(xì)胞液換位無糖培養(yǎng)基 4h，4h后恢復(fù)正常培養(yǎng)稱為復(fù)灌)以及在培養(yǎng)基中添加7天亞致死量的CoCl2來誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)間化學(xué)缺氧的這幾種模型[5～8]。首先，制備純化的OPCs方法如下[9]：從出生后的第2天的SD大鼠斷頭取腦，冰上分離大腦皮質(zhì)，胰酶消化腦組織后，得到的混合膠質(zhì)細(xì)胞在Neurobasal培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，補(bǔ)充有血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor AA, PDGF-AA)和堿性成纖維細(xì)胞(basic fibroblast growth factor，bFGF)生長(zhǎng)因子3天。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，兩次梯度離心去除小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞后得到純化的OPCs。這些純化培養(yǎng)的細(xì)胞可以通過神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞抗原2(neuron-glia antigen 2, NG2)的免疫熒光染色鑒定，超過95%的培養(yǎng)細(xì)胞是OPCs。然后將純化培養(yǎng)后的OPCs放入以上描述的各體外損傷模型中。損傷的同時(shí)還可以添加藥物共同孵育，通過對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的觀察(凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞與細(xì)胞間界限不清晰，成團(tuán)塊狀生長(zhǎng))以及MTT試驗(yàn)細(xì)胞活力檢測(cè)或者TUNEL凋亡測(cè)試就能對(duì)該藥物是否有神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)估。

2.少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖試驗(yàn)：如果要對(duì)藥物對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行評(píng)估，可以通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，或者通過ki-67或者Brdu染色對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記進(jìn)行計(jì)算[10]。結(jié)合以上OPCs體外缺血模型能夠用來評(píng)估哪些因子能直接妨礙OPCs存活或者抑制其增殖，因此可以基于這些因子進(jìn)而篩選出模擬缺血缺氧條件下對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用的藥物。另外，還可以進(jìn)一步闡明缺血缺氧條件下OPCs死亡的分子機(jī)制。

二、OPCs遷移試驗(yàn)

1.Transwell試驗(yàn):Transwell是一種上室可分離的雙層培養(yǎng)板，中間以聚碳酸酯膜相隔。方法如下：試驗(yàn)時(shí)將OPCs以5×104個(gè)細(xì)胞(分布在50μl DMEM以及0.5% FBS培養(yǎng)液中)的密度種植在上邊小室中，下面小室中添加同樣培養(yǎng)液[11]。Transwell試驗(yàn)有兩種模式，分別可以考察藥物或者因子對(duì)細(xì)胞的趨化性/趨藥性以及趨動(dòng)性。僅在下室添加藥物考察趨藥性(上下室藥物濃度不同)，而趨動(dòng)性為上下室都添加相同濃度的藥物。趨藥性表明對(duì)細(xì)胞的直接吸引力/排斥力，而趨動(dòng)性表明藥物對(duì)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)水平的作用。最后對(duì)穿過聚碳酸酯膜進(jìn)入到下室的細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行固定，染色然后拍照統(tǒng)計(jì)，就可以判定該藥物對(duì)OPCs遷移作用。作為最常見的體外遷移試驗(yàn)，這種方法有諸多優(yōu)點(diǎn)。首先，試驗(yàn)周期短，試驗(yàn)結(jié)果明顯。其次，由于Transwell小室中需要加的液體量相對(duì)較小，因此同其他遷移試驗(yàn)相比生長(zhǎng)因子或者拮抗劑等藥物需要添加的量少。另外，雖然最終結(jié)果是以清點(diǎn)遷移后的細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)，屬于勞動(dòng)密集型的方法，但卻相對(duì)客觀、準(zhǔn)確。但這個(gè)方法也有一個(gè)缺點(diǎn)，即需要大量的細(xì)胞，而且Transwell小室的只能一次使用，不能循環(huán)利用，且價(jià)格不便宜。

2.瓊脂糖遷移試驗(yàn):瓊脂糖遷移試驗(yàn)是將分離后的的OPCs以5×107個(gè)細(xì)胞/毫升的密度重懸于SATO培養(yǎng)液中(添加10%FBS以及0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖)，繼續(xù)放在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(防止此時(shí)瓊脂糖硬化)[12]。取1.5μl上述重懸液于24孔板中央，緊接著將培養(yǎng)板放在4℃冰箱中15min用于硬化瓊脂糖。冷卻后，在瓊脂糖液滴周圍添加50μl SATO培養(yǎng)液，2h后繼續(xù)沿著孔壁添加450μl SATO培養(yǎng)液，此時(shí)或24h后可在SATO培養(yǎng)液中添加待測(cè)試的藥物或因子。之后的1～6天，每天記錄遷移出瓊脂糖液滴的OPCs離液滴最遠(yuǎn)的距離。距離越遠(yuǎn)表示遷移能力越強(qiáng)。因?yàn)樵撨w移試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，必須在SATO培養(yǎng)液中添加抑制OPCs增殖的阿非迪霉素(aphidicolin)用于排除OPCs增殖可能對(duì)其遷移結(jié)果的影響。

首先，這個(gè)試驗(yàn)?zāi)茉诟嗟臅r(shí)間點(diǎn)來評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移的程度。其次，在試驗(yàn)開始以后能夠通過添加或者撤銷拮抗劑，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。但是缺點(diǎn)在于試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，并且試驗(yàn)過程中，少突膠質(zhì)細(xì)胞能合成、分泌其他能影響遷移的因子，干擾試驗(yàn)。

3.劃痕試驗(yàn):劃痕試驗(yàn)是在鋪滿單層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中人為地創(chuàng)造一條缺口，即“傷痕”[13]。接著缺口兩邊的細(xì)胞會(huì)移動(dòng)，慢慢“愈合”這一“傷痕”。首先需要在培養(yǎng)皿中種上約能覆蓋培養(yǎng)皿70%～80%面積的細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀在培養(yǎng)皿中間劃開一條細(xì)胞缺口。接著通過換液，懸浮的細(xì)胞會(huì)被清洗掉。然后用添加了待測(cè)藥物或因子的SATO培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(不添加生長(zhǎng)因子)。最后，24h或48h后，對(duì)越過缺口的OPCs數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

劃痕試驗(yàn)是分析細(xì)胞遷移試驗(yàn)中最簡(jiǎn)單，也是花費(fèi)最少的方法。整個(gè)試驗(yàn)所需的材料并無特殊，且實(shí)驗(yàn)條件不苛刻，易改良。其次，還能觀察到少突膠質(zhì)細(xì)胞遷移中的形態(tài)。但是不像Transwell試驗(yàn)，劃痕試驗(yàn)中不能制造化學(xué)梯度，因此不能檢測(cè)對(duì)某種因子或藥物的趨化性。而且劃痕試驗(yàn)比較費(fèi)時(shí)，首先需要10～15天來種植細(xì)胞到培養(yǎng)皿以及劃痕，之后還需要1～2天來觀察劃痕后的遷移結(jié)果。最后一個(gè)缺點(diǎn)是由于試驗(yàn)在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，因此需要大量的細(xì)胞以及試驗(yàn)藥物。

三、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化模型

1.少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng):少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)是在OPCs培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)[14]。純化后的OPCs以2.5×104個(gè)細(xì)胞/平方厘米接種在培養(yǎng)板上(此時(shí)培養(yǎng)液為SATO，添加1%青霉素/鏈霉素，1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑以及0.5% FBS, 10ng/ml PDGF-AA 以及10ng/ml FGF-2)。添加PDGF-AA和FGF-2是為了促進(jìn)OPCs的黏附、生存以及增殖。以O(shè)PCs培養(yǎng)液培養(yǎng)1天后，將原培養(yǎng)液中的PDGF-AA以及FGF-2換成3%FBS后隨即進(jìn)入分化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)的細(xì)胞就是以成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞為主的細(xì)胞，即80%以上細(xì)胞表達(dá)髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)，少部分細(xì)胞表達(dá)NG2。

2.少突膠質(zhì)細(xì)胞分化形態(tài)分析:這是評(píng)價(jià)增殖階段或者分化階段添加的藥物或因子能否對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程起抑制作用的重要步驟?？梢酝ㄟ^分別計(jì)算OPCs細(xì)胞數(shù)(NG2陽性)以及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)(MBP陽性)的變化來說明藥物對(duì)OPCs分化的作用，如果抑制分化，應(yīng)表現(xiàn)為OPCs細(xì)胞數(shù)增多，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞減少或不變[15]。另外，由于少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中，形態(tài)會(huì)逐漸變化。因此在MBP陽性細(xì)胞中，針對(duì)其形態(tài)不同分為簡(jiǎn)單分枝的少突膠質(zhì)細(xì)胞，復(fù)雜分枝的少突膠質(zhì)細(xì)胞以及部分形成膜結(jié)構(gòu)的少突膠質(zhì)細(xì)胞。而對(duì)此進(jìn)行的分類統(tǒng)計(jì)可以從形態(tài)上直接說明OPCs分化過程是否受到影響。也可以通過Image J軟件進(jìn)行單個(gè)MBP陽性細(xì)胞的細(xì)胞直徑以及分枝復(fù)雜程度的評(píng)判，最終結(jié)果以單位直徑的分枝數(shù)計(jì)算，但是最少需要統(tǒng)計(jì)50個(gè)細(xì)胞。

四、少突膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系

脊髓背角神經(jīng)元(dorsal root ganglion, DRG)與少突膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)[16]。首先需要培養(yǎng)DRG神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元由孕期15天大鼠中獲取，并在37℃下用木瓜蛋白酶，1-半胱氨酸和DNA酶解離60min。解離后，加入含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基以終止酶作用，離心5min收集細(xì)胞。最后，將150μl密度為1.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液涂布在涂有多聚賴氨酸和生長(zhǎng)因子減少的基質(zhì)膠的蓋玻片上，并在補(bǔ)充有10%FBS的DMEM(含1%青霉素/鏈霉素和100ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子)中培養(yǎng)21天。為了去除污染細(xì)胞，在接種后在1、4和7天用5-氟-2′-脫氧尿苷將培養(yǎng)物脈沖3次，持續(xù)48h。培養(yǎng)基每2天更換1次，21天后培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。然后，按上述方法分離培養(yǎng)OPCs。最后，將純化的OPCs以每個(gè)蓋玻片7.5×104的密度接種到神經(jīng)元上。共培養(yǎng)物保持15天，培養(yǎng)基每2～3天更換一次。髓鞘形成開始于共培養(yǎng)后的第6天，并且可以觀察到在第9天附近形成第一髓鞘。在14天大多數(shù)OPCs已經(jīng)分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞并且發(fā)生了廣泛的髓鞘形成。神經(jīng)突密度與形成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞百分比之間的關(guān)系為髓鞘分析提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。共培養(yǎng)體系的優(yōu)點(diǎn)是能保持少突膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用的生理相關(guān)性并維持體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的便利性，且這種培養(yǎng)體系可以研究髓鞘形成而沒有其他類型神經(jīng)細(xì)胞的混淆效應(yīng)。

五、小腦切片培養(yǎng)

盡管體外細(xì)胞培養(yǎng)是非常有用且易于獲得的模型，但它們的主要缺點(diǎn)在于生長(zhǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板上，而在于喪失了三維結(jié)構(gòu)。因此，利用上述體外模型，不可能維持正常結(jié)構(gòu)以及腦組織中存在的所有細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。為了克服這個(gè)問題，有人使用離體腦切片培養(yǎng)研究不同的神經(jīng)生物學(xué)過程，這樣可以保留支持所有組織回路和相互作用的三維建筑組織。切250～400μm的厚腦片，置于半乳膠膜上生長(zhǎng)，并保持氣-液界面，這導(dǎo)致更少更薄的組織并且維護(hù)和處理更為簡(jiǎn)單。當(dāng)主要目標(biāo)是評(píng)估髓鞘形成的變化時(shí)，通常使用器官型小腦切片培養(yǎng)物，可以在視覺限定的區(qū)域中評(píng)估少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟過程和髓鞘形成過程。事實(shí)上，小腦中的髓鞘形成發(fā)生在出生后，來自早期出生后動(dòng)物的小腦切片培養(yǎng)物復(fù)制了體內(nèi)髓鞘形成過程[11]。此外，小腦是特定區(qū)域哺乳動(dòng)物大腦中最大的纖維束，即白質(zhì)束，這使得它成為評(píng)估髓鞘形成有利和實(shí)用的模型。

六、展 望

用于評(píng)估少突膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷、再生的體外模型盡管由于缺乏腦回路以及缺乏系統(tǒng)循環(huán)和完整的體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而受到限制，但仍然是用于評(píng)估化合物/藥物的細(xì)胞毒性或治療功效的相對(duì)簡(jiǎn)單且有用的工具。因?yàn)轶w外模型能直接鑒定不同損傷或疾病的靶點(diǎn)的同時(shí)，在相同培養(yǎng)條件下對(duì)針對(duì)該新靶點(diǎn)藥物的效果進(jìn)行直接測(cè)定，因而能節(jié)約體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物數(shù)量，縮短研究周期。另外，體外模型更能聚焦少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷或再生的不同階段進(jìn)行研究，排除整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)因無法剝離損傷與再生的各個(gè)階段的干擾。而在與神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)或者小腦切片模型中，一定程度上可以囊括其他細(xì)胞對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響，因而能在某種程度上降低非整體研究的局限性。