流式細(xì)胞術(shù)檢測急性白血病微小殘留病的應(yīng)用價值

曹 琳 宋鏡南

信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南省信陽市 464000

急性白血病(AL)是發(fā)生在造血干細(xì)胞水平上的惡性腫瘤，按照其分化的系別不同，分為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)兩大類[1]。AL 診斷時體內(nèi)白血病細(xì)胞總數(shù)約1012，誘導(dǎo)化療達到完全緩解后，白血病細(xì)胞總數(shù) <109，這種體內(nèi)殘存的少量白血病細(xì)胞稱為白血病微小殘留病(MRD)。AL在現(xiàn)有治療技術(shù)下完全緩解率明顯增加，但仍有一些患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)的情況[1]。治療過程中的定期監(jiān)測有助于對化療敏感度及整體治療情況的評估。既往常通過對骨髓細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察評估病情，然而這種方法的敏感性和特異性均有限，可能會由于對殘留疾病的錯誤評估而出現(xiàn)過度治療或治療不足的情況。因此，需要更準(zhǔn)確和特異的方法來檢測殘留白血病細(xì)胞。

1 流式細(xì)胞術(shù)檢測MRD的優(yōu)勢

檢測殘存白血病細(xì)胞，需要在患者發(fā)病時找到該患者白血病細(xì)胞的特異標(biāo)志，包括遺傳學(xué)、分子學(xué)及免疫學(xué)的特征。這些特征往往是正常血細(xì)胞所沒有的，因此利用這些標(biāo)志可與正常細(xì)胞進行鑒別，特異地識別白血病細(xì)胞。

1.1 熒光原位雜交技術(shù)(FISH) FISH使用染色體或基因特異核酸探針檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)的異常，可對特異的 DNA 序列進行分析。但該方法僅適于部分具有特殊遺傳學(xué)特征的白血病細(xì)胞，靈敏度僅為 10-2～10-3。FISH方法雖可明確初診時白血病細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)上的改變，但敏感性較低，檢測結(jié)果受分裂相多少的影響。若與其他技術(shù)結(jié)合亦可提高其靈敏度[2]。Wang等[3]將流式細(xì)胞術(shù)與FISH結(jié)合，對AML患者先利用流式細(xì)胞儀篩選出CD34+CD38-細(xì)胞，再對分選細(xì)胞進行FISH，熒光顯微鏡下分析FISH+CD34+CD38-細(xì)胞(白血病干細(xì)胞)的比例，此方法富集白血病細(xì)胞后再應(yīng)用FISH檢測MRD，可提高白血病細(xì)胞的檢出率。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCR技術(shù)通過在體外大量擴增特定的DNA片段，再對擴增后片段進行檢測。應(yīng)用 PCR檢測ALL 患者 MRD 時，常采用免疫球蛋白(Ig)和/或 T 細(xì)胞受體(TCR)基因重排序列作為標(biāo)志。ALL 白血病細(xì)胞起源于單個早期病變淋巴細(xì)胞，大多數(shù)具有克隆性 Ig 基因和/或 TCR 基因重排，因此可通過IgH、IgK、TCRαβ、γδ等標(biāo)志物檢測MRD。約 90% 的ALL 兒童患者的MRD可通過重排基因進行檢測，該方法敏感性達10-4[4]。實時熒光定量PCR(RQ-PCR)通過實時測定PCR產(chǎn)物上的熒光物質(zhì)，可實時檢測PCR產(chǎn)物，靈敏度可達到10-6，是目前檢測MRD靈敏度最高的方法。RQ-PCR可對含有融合基因(PML/RARa、AML1/ETO、CBFβ/MYH11)、突變基因(FLT3、NPMl)和異常表達基因(WT1)的白血病亞型進行 MRD 檢測，通過對異?；驒z測的高度敏感性，可將白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分。但是僅有約 40% ALL和30%的AML具有異常的分子生物學(xué)標(biāo)記[5]，對其余多數(shù)無分子生物學(xué)異常標(biāo)記的患者并不適用。而對于具有異常分子標(biāo)記的AL中，由于PCR產(chǎn)物的數(shù)量與白血病細(xì)胞數(shù)量之間沒有明確的比例關(guān)系，因此只能對殘存的白血病細(xì)胞進行定性監(jiān)測，無法做出精確評估。此外，白血病細(xì)胞的分子標(biāo)記的不穩(wěn)定性也為檢測增加了難度。在白血病治療或復(fù)發(fā)過程中，分子標(biāo)記可能發(fā)生變化，使PCR技術(shù)出現(xiàn)漏檢，不僅增加了結(jié)果的假陰性率，也需要探索新的分子標(biāo)記[2]。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM) FCM檢測急性白血病微小殘留病是利用白血病細(xì)胞上白血病相關(guān)的免疫表型(LAIP)的表達與正常細(xì)胞的區(qū)別，從而成為區(qū)分白血病細(xì)胞和正常細(xì)胞的一種技術(shù)方法，可對檢測的細(xì)胞進行快速多參數(shù)的定量分析，靈敏度達10-4～10-5[6]。多色 FCM 是檢測 ALL-MRD 的方法之一，可從104或更多正常細(xì)胞中檢測出1個白血病細(xì)胞， 3、4種熒光FCM 的引進增加了FCM檢測的靈敏度和適用范圍[7]。目前已擴展到6～9色標(biāo)記，多色標(biāo)記可以提供LAIP的多項指標(biāo)，降低了識別難度，大大提高了 MRD 檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度及適用性[4]。FCM可對LAIP進行檢測，不受分子生物學(xué)異常的影響，對殘留白血病細(xì)胞進行準(zhǔn)確定量，比PCR技術(shù)更直觀，應(yīng)用更廣泛[8]，現(xiàn)已成為檢測 MRD 最有前景的一種方法。

2 FCM對MRD的免疫學(xué)檢測

隨著多色熒光的使用，F(xiàn)CM對MRD的檢測更快速準(zhǔn)確。但早期由于對細(xì)胞單克隆抗體標(biāo)記物的認(rèn)識較少，限制了MRD的免疫學(xué)研究發(fā)展。例如TdT和CD10不僅在大多數(shù)淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達，也可出現(xiàn)在正常前體B細(xì)胞中。因此不能使用TdT和CD10對骨髓中的異常細(xì)胞進行甄別[9]。然而白血病細(xì)胞上的LAIP與正常細(xì)胞具有明顯的差異，可據(jù)此區(qū)分出白血病細(xì)胞。LAIP主要包括表達跨系列或交叉系列抗原標(biāo)志、跨期或不同期的抗原共表達、抗原表達量的異常、散射光異常等4種類型。例如，在一些B-ALL和AML中可表達CD34/CD19/CD20和CD34/CD56，這些免疫表型組合在正常細(xì)胞中極少表達。CD3/TdT除了在胸腺中發(fā)育的T細(xì)胞有所表達外，在其他正常造血細(xì)胞中幾乎無表達，因此可將CD3/TdT作為判斷T-ALL的一項參考指標(biāo)。

目前，F(xiàn)CM診斷MRD的方法主要有兩種[7，10]，第一種是在初發(fā)時確定急性白血病的類型，篩選出LAIP，并在緩解后以該LAIP監(jiān)測殘留的白血病細(xì)胞。在此方法中，緩解后陽性細(xì)胞的量與在診斷時檢測量的比較對于臨床診斷及預(yù)后判斷有重要的價值。另一種方法是先根據(jù)正常骨髓標(biāo)本抗原表達情況建立陰性的雙軸點圖，若抗原出現(xiàn)在陽性區(qū)域范圍內(nèi)即可反映其異常表達。正常的骨髓細(xì)胞和白血病細(xì)胞若顯示表達相似的免疫抗原，可以通過它們的數(shù)量差異來區(qū)分。例如在一些B-ALL病例中，在CD19陽性的細(xì)胞中可出現(xiàn)CD10和CD34的過表達、CD45和CD38的失表達[11]。

2.1 T-ALL 幾乎所有的T-ALL均表達TdT和泛T標(biāo)志(CD2、核質(zhì)CD3、CD5、CD7)等。CD34抗原在T-ALL陽性比例在30%左右，可用于TdT表達較弱或陰性的病例。通過使用CD19和MHC-Ⅱ標(biāo)記，可以進一步增強T-ALL細(xì)胞的檢測，這些標(biāo)記在大多數(shù)正常骨髓TdT+細(xì)胞上都有較強的陽性表達，但在T-ALL細(xì)胞上的表達為陰性。

2.2 B-ALL B-ALL的MRD檢測較為復(fù)雜，需要使用較多的抗體組合。CD19、CD10、CD34或TdT的同時表達通常用于識別不成熟的B細(xì)胞。在近30%的病例中，抗原表達的數(shù)量差異也可用于區(qū)分白血病細(xì)胞和正常細(xì)胞。CD38、CD45和CD22在正常的未成熟B細(xì)胞和白血病細(xì)胞中均有不同量表達，也可通過對髓系和NK相關(guān)分子的抗體檢測到區(qū)分正常細(xì)胞和白血病細(xì)胞。結(jié)合以上這些免疫表型可以檢測高達85%的B-ALL，敏感度達到10-4[12]。

2.3 AML 據(jù)報道[13]，約2/3以上的AML病例發(fā)現(xiàn)免疫表型的表達異常，但這些異常的免疫表型在MRD檢測中的敏感性尚不清楚。CD34/CD56這兩種免疫抗原在近20%的兒童AML中同時表達，且與t(8;21)(q22;q22)相關(guān)，且此組合的靈敏度可以達到10-4，是目前較為適合MRD檢測的抗原組合。由于70%～80%的AML患者表達CD87，而在正常CD34+細(xì)胞中僅表達0.2%，因此CD34和CD87是另一種可能有用的組合[14]。

3 總結(jié)和展望

近期前瞻性研究報道[15]，MRD的評估是影響兒童期ALL治療結(jié)果的獨立預(yù)后因素。治療早期MRD的檢測對疾病的預(yù)后有預(yù)測價值。因此在西方國家，幾乎所有的兒童ALL患者和大部分成年ALL患者都會進行MRD監(jiān)測用于區(qū)分不同的危險度和評估治療效果[12]。隨著多色流式細(xì)胞儀的發(fā)展，F(xiàn)CM 檢測 MRD的準(zhǔn)確性和靈敏度均有很大的提升。FCM的應(yīng)用范圍廣，但其結(jié)果會受到設(shè)門方式、抗體組合、操作者技術(shù)水平等多方面的影響，不同實驗室之間檢測結(jié)果有差異，且缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前白血病治療已經(jīng)進入MRD時代，MRD檢測的重要性已經(jīng)得到充分的證實，因此在今后的臨床研究中，MRD檢測將對白血病的治療和預(yù)后判斷有著重要的意義，也將成為FCM在血液學(xué)應(yīng)用的重要部分。