碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌分子流行病學分析

宋羽希， 王 琴， 胡 健， 朱忠立， 黎俊雅， 向朝雪， 李福祥，

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集本院2015年1月-2018年12月臨床各種標本分離出CRE 121株（剔除同一患者分離的重復菌株）。CRE納入標準為 2015年美國疾病控制與預防中心頒布的標準（ 見《醫(yī)療機構(gòu)耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌防控指南》），即亞胺培南MIC≥ 4 mg/L 和/或厄他培南MIC≥2 mg/ L。所有細菌均由VITEK 2-Compact全自動微生物分析儀進行鑒定和體外藥敏試驗。藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI判斷標準。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌 ATCC 25922、陰溝腸桿菌 AT C C 7 0 0 3 2 3、肺炎克雷伯菌 ATCCBAA 1705，購自中國工業(yè)菌種保藏所。

1.1.2 儀器和試劑 VITEK 2-Compact全自動微生物分析鑒定儀、GNI鑒定卡、AST-GN13藥敏卡均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司；PCR、凝膠電泳（Marker DL2000）試劑均購自北京擎科生物科技有限公司；PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；電泳儀、凝膠成像儀購自北京君意東方有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因檢測 細菌DNA提取嚴格按照提取試劑盒（DP302）說明書操作。相關(guān)擴增引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1[3-7]。 13種相關(guān)耐藥基因檢測反應總體系均為：總體積50 μL，其中PCR Master MIX 25 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，雙蒸水22 μL。PCR反應條件為：98 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸 10 s，36個循環(huán)，最后72 ℃ 延 伸 5 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。最后，陽性擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司完成測序。 序列比對使用Chromas軟件查看測序圖，測序結(jié)果文本序列用MegAlign軟件直接作BLAST Search比對，以證實擴增產(chǎn)物為目的基因片段。

表1 PCR 引物序列及擴增片段Table 1 PCR primer sequences used in this study and the corresponding ampilied fragments

1.2.2 腸桿菌科基因間重復一致序列P C R（E R I C-P C R） 使用E R I C-P C R 對同種屬的細菌進行同源性分析。E R I C 1：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，ERIC2：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'。結(jié)果判讀：同源性菌株擴增條帶位置完全相同則具有同一ERIC基因指紋圖譜；主條帶位置相同，副條帶相差1～2條則為亞型；不符合上述條件者則具有不同ERIC基因指紋圖譜，判定為非同源性菌株[3]。

1.2.3 臨床資料 收集CRE分離株感染患者的人口學資料（包括性別、年齡、入住科室、分離標本）、合并癥（糖尿病、急慢性心功能衰竭、慢性呼吸系統(tǒng)疾病、終末期腎病透析、肝硬化、腫瘤）、過去30 d手術(shù)史及內(nèi)鏡檢查史、過去2周侵襲性操作（氣管插管/氣管切開、機械通氣）及ICU入住史、CRE感染患者28 d死亡率。感染診斷標準：肺炎診斷標準根據(jù)國家衛(wèi)生行業(yè)標準（WS382-2012）；泌尿系統(tǒng)感染、血流感染、腹部臟器感染、傷口軟組織感染均參考2001年衛(wèi)生部醫(yī)院感染診斷標準[8]。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料采用n（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 菌種分布

121株CRE中檢出最多的為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP），其次為大腸埃希菌和陰溝腸桿菌。見表2。

表2 121 株CRE 菌種分布Table 2 Species distribution of 121 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains[n（%）]

2.2 菌株來源

取自呼吸道標本56株（46.3%），尿液24株（19.8%），血液14株（11.6%），膽汁8株（6.6%），傷口分泌物6株（5.0%），其他無菌體液13株（10.7%）。

2.3 科室分布

C R E 分離自住院患者11 8 株，門診3 株。121株中干部ICU 19株（15.7%），普外科18株（14.9%），神經(jīng)外科16株（13.2%），干部病房11株（9.1%），重癥醫(yī)學科8株（6.6%），康復科6株（5.0%），其余40株（33.1%）分布在其他18個病區(qū)。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

121株CRE對青霉素、頭孢菌素類抗生素耐藥率高，對阿米卡星的耐藥率最低。見表3。

2.5 基因檢測結(jié)果分析

2.5.1 耐藥基因檢測 121株CRE中，產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌（CPE）96株（79.3%），其中攜帶blaKPC基因65株（67.7%），blaNDM-1基因25株（26.0%），blaOXA-48基因7株（7.3%），blaVIM基因2株（2.1%），同時攜帶2種基因3株（3.1%）。121株中攜帶blaSHV基因56株（46.3%），blaTEM基因57株（47.1%），blaDHA基因45株（37.2%）。未檢測到blaGES、blaIMP基因。見表4。部分基因電泳結(jié)果見圖1、2。

2.5.2 膜孔蛋白基因檢測 52株大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣克雷伯菌中，OMPF缺失/突變25株（48.1%），OMPC缺失/突變44株（84.6%）。56株肺炎克雷伯菌中，OMPK35缺失/突變20株（35.7%），OMPK36缺失/突變51株（91.1%）。見表5。

2.6 同源性分析

ERIC-PCR電泳結(jié)果顯示56株CRKP大致具有5種不同類別的指紋圖譜，其中A型40株、B型5株、C型7株、D型2株、E型2株；26株耐碳青霉烯類大腸埃希菌大致有3種類型的指紋圖譜，A型14株、B型8株、C型4株；23株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌大致有3種類別的指紋圖譜，A型13株，B型3株，C型7株。

表3 CRE 對常用抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 3 In vitro susceptibility of 121 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains to antimicrobial agents[n（%）]

表 4 CRE 碳青霉烯酶基因攜帶情況Table 4 Carbapenemase genes identif ied from CRE strains[n（%）]

圖1 blaKPC 基因PCR 電泳結(jié)果Figure 1 Partial electrophoretic results of the amplicons after PCR ampilication of blaKPC gene

圖2 blaNDM-1 基因PCR 電泳結(jié)果Figure 2 Partial electrophoretic results of the amplicons after PCR ampilication of blaNDM-1 gene

表5 大腸埃希菌和腸桿菌屬細菌外膜蛋白改變情況Tabel 5 Outer membrane porin in Escherichia coli and Enterobacter species[n（%）]

2.7 CRE檢出患者的臨床信息

121例CRE檢出患者中， 3例為門診患者，有2例呼吸內(nèi)科為肺炎克雷伯菌，泌尿外科1例為陰溝腸桿菌。118例住院患者中男85例（72.0%），女33例（28.0%），年齡為9 ～106歲，平均（65.1±20.0）歲。其余臨床特征見表6。

表6 118 例住院CRE 檢出患者的臨床特征Table 6 Clinical details of 118 patients with carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates（%）

表6 （續(xù)）Table 6（continued）（%）

3 討論

本研究中CRE細菌主要為CRKP，且2018年檢出率明顯增高，是2015-2017年CRKP總和的4倍，這與CHINET監(jiān)測數(shù)據(jù)中CRKP檢出率趨勢一致[9]。本院CRE攜帶碳青霉烯酶基因以blaKPC為主，其次為blaNDM-1，這與國內(nèi)外多篇報道相似[10-11]。96株產(chǎn)碳青霉烯酶菌中7株攜帶blaOXA-48基因，OXA-48耐藥基因最早于2001年在土耳其被發(fā)現(xiàn)，隨后很快引起醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行，有研究表明OXA-48基因比KPC、NDM基因更易于在腸桿菌科細菌中播散[12]。產(chǎn)VIM酶的CRKP最早于2001-2003年在南歐被發(fā)現(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)的2株攜帶blaVIM基因的細菌均為肺炎克雷伯菌。部分CRE不僅攜帶碳青霉烯酶基因，還同時合并膜孔蛋白缺失或突變，可見CRE的多重耐藥是多機制的共同作用導致。2株CRE未檢測到相關(guān)耐藥基因及膜孔蛋白缺失突變現(xiàn)象，其可能攜帶本研究未檢測到的耐藥基因。

ERIC-PCR是通過擴增腸桿菌科細菌基因組中所特有的一段基因間重復序列，產(chǎn)物通過核酸電泳獲得條帶，再通過比對電泳條帶分類，適合同源性初步篩查。本次ERIC-PCR結(jié)果顯示部分菌株同源性非常高，表明我院CRE存在克隆傳播現(xiàn)象，應當引起重視。

腸桿菌科細菌是人體重要條件致病菌，本研究檢出的CRE中有45株考慮為定植，但有研究報道，CRE定植患者有10%～30%概率發(fā)生感染，同時CRE定植者也是潛在的播散者[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)16.4%（12/73）患者在感染CRE前2周行內(nèi)鏡治療，內(nèi)窺鏡設計結(jié)構(gòu)復雜，需要深度消毒滅菌，否則會成為細菌傳播的途徑。本研究中，CRE感染患者總病死率為32.9%（24/73），其中血流感染的總病死率為35.7%（5/14），這與國內(nèi)外報道結(jié)果基本一致[1，14-15]。

CRE細菌培養(yǎng)鑒定通常需要2～3 d，臨床醫(yī)師常常采取經(jīng)驗性治療，但有大量關(guān)于CRE菌血癥和膿毒癥研究表明，不恰當?shù)慕?jīng)驗抗菌治療與死亡率增加獨立相關(guān)[16]，這強調(diào)了快速診斷和評估的重要性。CRE引起的感染治療棘手，目前主要的治療藥物為多黏菌素、替加環(huán)素、氨基糖苷類抗生素，而多黏菌素耐藥菌株的出現(xiàn)導致對CRE感染的治療更加困難[17]。綜上，針對CRE要以防控為主，醫(yī)護人員需加強對耐藥菌處理的相關(guān)知識，對高危人群進行早期篩查，醫(yī)院需建立有效的監(jiān)測體系，加強感控強度，做好醫(yī)院感控防 護。