Xpert HIV-1 病毒載量檢測系統(tǒng)用于HIV-1 病毒載量檢測的臨床價值

楊 坤， 王 靜， 李同心， 李俊剛， 李 梅， 羅福龍， 鄧仁麑， 劉 敏， 聶曉平， 陳耀凱

HIV的載量水平與HIV感染后病情發(fā)展和預后 有密切關(guān)系[1-2]，檢測感染者血漿中HIV病毒載量（viral load）對于預測疾病進程、制訂治療方案、監(jiān)測用藥療效和輔助診斷等[3-4]均有重要臨床參考價值。實時熒光定量PCR擴增技術(shù)是目前臨床廣泛使用的HIV-1病毒載量檢測技術(shù)之一，國內(nèi)主要使用Abbott m2000或COBAS集核酸提取和核酸檢測為一體的病毒載量檢測系統(tǒng)，適合于大批量樣本的檢測[5-7]。Xpert HIV-1病毒載量（Xpert HIV-1 VL）檢測是依托全自動GeneXpert儀器進行反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的體外測試方法，在40～1×107拷貝（cp）/mL的線性范圍內(nèi)檢測血漿中HIV-1 RNA含量[8]。WHO在2017年7月推薦該技術(shù)作為一種HIV-1 VL體外檢測手段[9-10]。本研究以Abbott m2000為標準，對比兩種方法檢測結(jié)果的一致性，探討Xpert HIV-1的臨床應用價值和優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機收集2017年7-11月重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心門診或住院患者血標本共191份，分別來自172例確診的HIV-1感染者和19例非HIV-1感染的其他疾病患者。HIV感染或艾滋病臨床診斷標準符合2015年中華醫(yī)學會感染病分會艾滋病學組制定的《艾滋病診療指南第三版（2015版）》[11]。其他疾病診斷也符合相應診斷標準。本研究取得了重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心倫理委員會同意。

1.2 試劑與儀器

GeneXpert Dx 系統(tǒng)（包括GeneXpert儀器，GeneXpert Software Version 4.6a）和HIV-1 VL檢測試劑盒均購自于美國Cepheid AB公司。Abbott m2000檢測系統(tǒng)（包括自動化樣本提取儀器，型號為Abbott m2000sp ；實時熒光定量PCR擴增與檢測儀器，型號為 Abbott m2000rt）、COBAS?TaqScreen MPX提取純化試劑盒和HIV-1核酸測定試劑盒（PCR-熒光法，Abbott Molecular Inc.）均購自美國Abbott公司。COBAS檢測系統(tǒng)（包括自動化樣本提取儀器，型號為COBAS?AmpliPrep；實時熒光定量P C R 擴增與檢測儀器，型號為COBAS?TaqMan 48），COBAS?AmpliPrep提取純化試劑盒和HIV-1型核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光法） COBAS?AmpliPrep/COBAS?TaqMan?HIV-1 Test，Version 2.0均購自美國Roche公司。

1.3 標本采集和保存

采集患者靜脈全血8 ～10 mL，EDTA-K2抗凝，輕輕上下顛倒混勻，3 h內(nèi)以離心半徑8.8 cm，1 500 r/min 離心10 min，分離血漿，收集于3支無菌的凍存管中，每支凍存管分裝體積大于1.2 mL，放入-20 ℃或以下冷凍保存，1周內(nèi)完成檢測。檢測前需對凍存樣本進行常溫解凍，解凍后樣本肉眼觀察澄清透明，可以直接用于病毒載量檢測；若樣本渾濁，則需低速離心（離心半徑8.8 cm，1 500 r/min 離心2 min）后取上清液用于病毒載量檢測。

1.4 檢測方法

1.4.1 Abbott m2000 檢測方法 將1 mL血漿樣本加入Abbott m2000sp核酸分離純化儀專用樣本孔里，儀器自動進行核酸提取與制備。使用Abboot m2000rt PCR檢測系統(tǒng)和配套的HIV-1型核酸測定試劑盒（PCR-熒光法）對核酸進行病毒載量檢測，有效定量檢測范圍：40～1×107cp/ mL。

1.4.2 Xpert HIV-1 VL檢測方法 按照說明書：打開Xpert HIV-1 VL檢測試劑盒加樣孔，取1 mL血漿樣本緩慢加入樣本孔里，關(guān)閉樣本孔蓋。打開GeneXpert儀器，運行GeneXpert Software Version 4.6a，將試劑盒掃描載入儀器檢測倉內(nèi)即開始病毒載量的檢測，90 min后觀察記錄檢測結(jié)果。結(jié)果解釋：Xpert HIV-1 VL測定的轉(zhuǎn)換因子為1 cp/mL=1.72 IU/mL，檢測線性范圍為40～1×107cp / mL。注意事項：每個檢測試劑盒只能檢測一份樣本；加樣過程不能產(chǎn)生氣泡；加樣后的試劑盒不能顛倒，且需4 h內(nèi)上機檢測。質(zhì)量控制：每個檢測試劑盒含有樣本容量充分性控制（SVA）、內(nèi)部定量標準高和低（IQS-H和IQS-L），及采樣處理控制（SPC）和探針檢查控制（PCC）對檢測全程進行內(nèi)部質(zhì)量控制。

1.4.3 COBAS檢測方法 對Abbott m2000和Xpert HIV-1 VL檢測結(jié)果不一致的血漿樣本重復檢測；對復檢結(jié)果不一致的樣本，采用COBAS進行檢測。COBAS檢測方法大致步驟：將1 mL血漿樣本加入COBAS?AmpliPrep核酸分離純化儀專用樣本孔里，儀器自動進行核酸提取與制備。使用COBAS?TaqMan 48 PCR檢測系統(tǒng)和配套的HIV-1型核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光法） COBAS?AmpliPrep/COBAS?TaqMan?HIV-1 Test，Version 2.0對核酸進行病毒載量檢測，檢測線性范圍為20～1×107cp/mL。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)處理，并用數(shù)據(jù)對數(shù)級進行繪圖和比較分析。定性結(jié)果分析使用Kappa值來判斷Xpert HIV-1 VL和對照方法檢測結(jié)果的一致性。定量結(jié)果分析使用一元線性回歸和Bland-Altman模型評價Xpert HIV-1 VL與對照方法定量檢測結(jié)果的一致性，檢驗水準α=0.05。Bland-Altman模型偏倚用兩試劑測定結(jié)果差值的均數(shù)和標準差SD描述，95%的一致性界限（LOA）位于-1.96SD和+1.96SD之間。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

191份樣本來自145例男性和46例女性患者，年齡范圍11～94歲，平均（46.0±16.7）歲；其中172例臨床診斷為HIV-1感染或艾滋?。ò?例艾滋病合并丙型肝炎病毒感染者），19例為非HIV-1感染者（8例肺結(jié)核患者、1例高血壓患者、1例支氣管擴張合并細菌感染患者和9例乙型肝炎病毒感染者）。

2.2 Xpert HIV-1 VL檢測結(jié)果

Xpert HIV-1 VL檢測191例患者病毒載量數(shù)值分布情況見圖1，以樣本病毒載量拷貝數(shù)的對數(shù)（log10）為橫坐標，以樣本例數(shù)的頻數(shù)為縱坐標。每個檢測范圍都有一定數(shù)量的樣本量，病毒載量檢測結(jié)果≥40 cp/mL的樣本例數(shù)168例，占總樣本的88.0%。1例艾滋病和19例非HIV-1感染者的血漿樣本Xpert HIV-1 VL檢測結(jié)果均為“陰性”。

圖1 191 例Xpert HIV-1 VL 檢測值的頻數(shù)分布Figure 1 Frequency distribution of HIV-1viral load detected by Xpert HIV-1 VL system in 191 cases

2.3 兩種檢測結(jié)果的一致性分析

對191份血漿樣本使用Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000進行HIV-1 RNA檢測的結(jié)果分析，見表1。1例艾滋病Xpert HIV-1 VL檢測結(jié)果為“陰性”，171例HIV-1感染血漿樣本檢測結(jié)果為“陽性”，與Abbott m2000檢測結(jié)果相同。19例非HIV-1感染者的血漿樣本Xpert HIV-1 VL檢測結(jié)果均為“陰性”，也與Abbott m2000檢測結(jié)果一致。兩種檢測結(jié)果陽性符合率、陰性符合率和總符合率均為100%， Kappa 值為 1.00。

表1 Xpert HIV-1 VL 和Abbott m2000 HIV-1 RNA 檢測結(jié)果的一致性分析Table 1 Consistency analysis of HIV-1 RNA detection results via Xpert HIV-1 VL and Abbott m2000（n）

2.4 兩種方法含量檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

1 9 1 份樣本含量檢測見表2。其中2 8 份樣本由于Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000檢測結(jié)果小于檢測下限（40 cp/mL）或大于檢測上限（107cp / mL），這些樣本的檢測結(jié)果無法作為連續(xù)型變量納入到定量分析。

表2 Xpert HIV-1 VL 和Abbott m2000 檢測結(jié)果分布Table 2 Distribution of the results by Xpert HIV-1 VL and Abbott m2000[n（%）]

以Abbott m2000的定量檢測結(jié)果的對數(shù)（log10）為x軸，Xpert HIV-1 VL的定量檢測結(jié)果的對數(shù)（log10）為y軸做散點圖（圖2）。建立回歸方程y= 1.025 1x+ 0.405 3。對回歸方程進行F檢驗，結(jié)果顯示F值為1 768.85，P＜0.001，方程差異在統(tǒng)計學上具有顯著意義。 線性回歸方程截距為0.405 3，95%CI（0.197 9～0.612 7），對截距進行t檢驗，結(jié)果顯示t值為3.845 1，P＜0.001，截距在統(tǒng)計學上具有顯著意義。線性回歸方程斜率為1.025 1，95%CI（0.976 9～1.073 3），對斜率進行t檢驗，結(jié)果顯示t值為42.057 7，P＜0.001，斜率在統(tǒng)計學上具有顯著意義。

172份樣本，用Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000測量結(jié)果對數(shù)值（log10）的平均值為橫軸，兩種試劑測量結(jié)果對數(shù)值（log10）的差值為縱軸做Bland-Altman 散點圖，結(jié)果分析見圖 3。LOA（x±1.96SD）為 -1.180 5～0.160 2；95.3%（164/172）的樣本位于LOA范圍內(nèi)，4.7%（8/172）的樣本位于LOA范圍外。Xpert HIV-1 VL檢測結(jié)果的對數(shù)值與Abbott m2000檢測結(jié)果的對數(shù)值的線性相關(guān)系數(shù)為0.957 6，95%CI（0.942 6～0.968 8）。

圖2 兩種方法的線性回歸相關(guān)性分析Figure 2 Linear regression correlation analysis of the two HIV-1 viral load assays

圖3 兩種方法的Bland-Altman 分析Figure 3 Bland-Altman analysis of the two HIV-1 viral load assays

2.5 兩種方法對于不同基因型HIV-1的檢測效果分 析

納入統(tǒng)計分析的191份樣本中有47例患者樣本有HIV-1的基因分型結(jié)果，BC重組型45例，B/B’型2例，并且這47例的樣本Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000檢測結(jié)果均為陽性。

3 討論

基于核酸檢測的實時熒光定量PCR是高通量HIV-1病毒載量檢測的首選方案[12]。然而，這些檢測中樣品制備復雜、儀器和操作人員及實驗室等要求高，檢測成本高、時間長。最近WHO指南建議用床旁檢測（point of care testing， POCT）代替核酸檢測[13]。Xpert HIV-1 VL是一種借助全自動儀器 GeneXpert進行RT-PCR反應的體外診斷方法，用于快速定量來自HIV感染者/AIDS血漿中的HIV-1 RNA含量，滿足POCT的要求。Xpert HIV-1 VL采用實時定量RT-PCR技術(shù)以達到高靈敏度，針對HIV-1群M亞型A、B、C、D、AE、F、G、H、AB、AG、J和K以及N、O等亞型，定量檢測最低限度為40 cp/mL，線性范圍為40～1×107cp / mL。每個測試在一個完全集成的封閉盒里完成，并在90 min內(nèi)提供結(jié)果[8]。

Xpert HIV-1 VL檢測系統(tǒng)、臨床使用較廣泛的COBAS檢測系統(tǒng)[5-7]和Abbott m2000檢測系統(tǒng)[5-6]均采用實時熒光定量PCR擴增技術(shù)檢測HIV-1 RNA含量，而且樣本的核酸提取方法的原理近乎相同，因此本研究采用Abbott m2000為對照，兩種方法檢測不一致時通過COBAS進行驗證，此研究方法與國外已發(fā)表的文獻[8，14-16]一致。本研究結(jié)果兩種方法陽性符合率、陰性符合率和總符合率均為100%， Kappa 值為1.00，說明Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000 HIV-1 RNA檢測結(jié)果高度一致。兩者線性回歸方程為：y= 1.025 1x+ 0.405 3，r=0.957 6，95%CI（0.942 6～0.968 8），以上結(jié)果顯示在臨床應用中Xpert HIV VL具有良好的靈敏度、準確性和穩(wěn)定性，對于血漿樣本中HIV RNA的檢測能力與Abbott m2000具有較好的臨床等效性，可用于定量檢測。有研究分別報道來自不同實驗室采用Xpert HIV-1 VL與Abbott m2000（或COBAS）的對比研究，兩種方法的相關(guān)系數(shù)范圍為0.81～0.99[17-20]，薈萃分析顯示Pearson和Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.94（95%CI：0.89，0.97）和0.96（95%CI：0.86～0.99）[11]，表明Xpert HIV-1 VL與參考方法病毒載量值之間非常高的一致性。

191份樣本中有9份干擾樣本取自病毒性肝炎患者，Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000檢測結(jié)果均為陰性，說明乙型肝炎病毒不會影響Xpert HIV-1 VL對HIV-1病毒的檢測結(jié)果。47份有基因型的樣本（BC重組型和B/B’型）Xpert HIV-1 VL和Abbott m2000的檢測結(jié)果相同，均為陽性，表明考核試劑盒對HIV-1中不同基因型有很好的檢測能力。

Xpert HIV-1 VL檢測與WHO認可的用于結(jié)核病診斷的Xpert MTB/RIF具有相同的GeneXpert運行平臺。Xpert MTB/RIF系統(tǒng)用于檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性，全世界使用該系統(tǒng)超過2 300萬[21-22]。結(jié)核病和艾滋病在發(fā)病人群、防治模式等方面具有一定的相似之處[23]，如果能整合兩者資源，在結(jié)核病和艾滋病雙向篩查、檢測等工作中，利用現(xiàn)有的GeneXpert平臺進行HIV病毒載量檢測可大大增加HIV-1 VL檢測的可行性。

總之，本研究證實Xpert HIV-1 VL用于檢測HIV-1 RNA具有很高的靈敏度、準確性和穩(wěn)定性，同時具有操作簡單、方便、安全、快捷等優(yōu)勢，對操作場地和人員無需特殊要求，適合臨床應 用。