MAST D73C 組合紙片法檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶

田東興， 張 泓

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）已引起了全球廣泛關(guān)注。產(chǎn)碳青霉烯酶（KPC酶、MβL酶、OXA-48酶等）是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制[1]，其可以通過(guò)質(zhì)粒、整合子等可移動(dòng)元件傳播引起CRE菌株的暴發(fā)流行[2]。產(chǎn)不同碳青霉烯酶的CRE菌株導(dǎo)致的感染用藥方案往往不同，如頭孢他啶-阿維巴坦可有效抑制產(chǎn)A類（如KPC、ESBL）、C類（如AmpC）、D類（如OXA-48）β內(nèi)酰胺酶等酶的細(xì)菌生長(zhǎng)，但對(duì)產(chǎn)B類金屬酶（如NDM、IMP）則無(wú)效[3]。因此迫切需要臨床微生物實(shí)驗(yàn)室能夠快速、準(zhǔn)確地明確碳青霉烯酶型別，幫助臨床及時(shí)選擇有效的抗菌藥物，控制CRE進(jìn)一步播散。本研究旨在分析兒童患者分離CRE中碳青霉烯酶類型分布情況，并為臨床提供一種簡(jiǎn)易的碳青霉烯酶型檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集2016年7月-2017年12月上海市兒童醫(yī)院臨床分離的240株非重復(fù)CRE菌株，包括肺炎克雷伯菌185株，大腸埃希菌31株，陰溝腸桿菌19株，產(chǎn)氣克雷伯菌5株。CRE定義為至少對(duì)一種碳青霉烯類藥物（亞胺培南、美羅培南或厄他培南）耐藥的腸桿菌科細(xì)菌[4]。所有菌株均采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）鑒定，質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922，購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS（德國(guó)Bruker公司），PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司），電泳儀、Gel Doc 2000紫外線投射凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。Taq酶、dNTPs、10×緩沖液（大連TaKaRa公司），瓊脂糖（西班牙Biowest公司），DL 2000 Marker、50×TAE緩沖液、Genegreen核酸染料（北京天根公司），MAST D73C組合紙片（英國(guó)MAST公司），哥倫比亞血平板、MH平板（法國(guó)梅里埃公司），抗菌藥物粉劑（大連美侖生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 碳青霉烯酶基因檢測(cè) 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA作為PCR模板[5]，擴(kuò)增碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaOXA-48-like、blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaBIC、blaSIM），引物序列參考文獻(xiàn) [6]，由上海生工有限公司合成。反應(yīng)體系共25 μL，包括DNA模板1 μL、20 μmol/L上下游引物各0.5 μL、10×緩沖液2.5 μL、dNTPs 2 μL、ddH2O 18.375 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物用含Genegreen核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外投射凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海賽音生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至blast網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.3.2 碳青霉烯酶 MAST D73C紙片法檢測(cè)組合紙片包括法羅培南（A組）、法羅培南+MβL抑制劑（B組）、法羅培南+KPC抑制劑（C組）、法羅培南+AmpC抑制劑（D組）、替莫西林+MβL抑制劑（E組）。按照CLSI M02文件中常規(guī)紙片擴(kuò)散法的操作要求將上述5張紙片放入涂布有受試菌的MH平板并輕壓，35 ℃孵育18～24 h后測(cè)量抑菌圈直徑[7]。陽(yáng)性質(zhì)控菌株為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)PCR確認(rèn)攜帶blaNDM、blaOXA-232、blaKPC基因的細(xì)菌，陰性質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。結(jié)果判讀規(guī)則見(jiàn)表 1。

表1 MAST D73C 組合紙片法結(jié)果判讀規(guī)則Table 1 Interpretive criteria of MASTDISCS? combi Carba plus discs system D73C for discriminating carbapenemase phenotypes

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算組合紙片法檢測(cè)碳青霉烯酶的靈敏度和特異度，并與PCR結(jié)果進(jìn)行一致性分析：Kappa值＜0.4，說(shuō)明一致性程度較差；Kappa 值在0.4～0.75，說(shuō)明一致性程度尚可；Kappa 值＞0.75，說(shuō)明一致性程度較好。Youden指數(shù)范圍0～1，越接近于1，說(shuō)明真實(shí)性越 好。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯酶基因PCR檢測(cè)

240株CRE經(jīng)PCR基因檢測(cè)有233株檢測(cè)到碳青霉烯酶基因，以blaNDM（96株，40.00%）為主，其次是blaOXA-232（69株，28.75%）、blaKPC-2（56株，23.33%）和blaIMP（10株，4.17%），另有2株同時(shí)攜帶2種碳青霉烯酶基因，7株CRE未檢出碳青霉烯酶基因。各菌種碳青霉烯酶基因檢出情況見(jiàn)表 2。

表2 240 株碳青霉烯酶基因型分布Table 2 The distribution of carbapenem-resistant genes in 240 Enterobacteriaceae strains[n（%）]

2.2 組合紙片法檢測(cè)碳青霉烯酶

231株單碳青霉烯酶基因表達(dá)陽(yáng)性的菌株，采用MAST D73C檢測(cè)有112株MβL酶陽(yáng)性，63株OXA-48酶陽(yáng)性，20株KPC酶陽(yáng)性，36株結(jié)果無(wú)法解釋。以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用MAST D73C判斷MβL酶和OXA-48酶的靈敏度均在80%以上，特異度均在95%以上，Youden指數(shù)和Kappa值顯示，區(qū)分產(chǎn)MβL酶和OXA-48酶菌株的真實(shí)性和一致性較好，見(jiàn)表3。判斷KPC酶的特異度較高（99.43%），但靈敏度較差（33.93%），真實(shí)性和一致性較差。2株產(chǎn)雙碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌用MAST D73C僅能判斷出一種型別。36株CRE采用MAST D73C組合紙片法檢測(cè)，獲得的結(jié)果無(wú)法解釋，經(jīng)PCR確認(rèn)有30株CRE產(chǎn)KPC酶，6株CRE產(chǎn)OXA-48酶。

表3 MAST D73C 檢測(cè)碳青霉烯酶型結(jié)果與PCR 方法比較Table 3 MASTDISCS? D73C versus PCR in identifying carbapenemases or the encoding genes

2.3 組合紙片法檢測(cè)KPC型碳青霉烯酶補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)

針對(duì)MAST D73C檢測(cè)KPC型碳青霉烯酶低靈敏度的缺陷，基于本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和PCR基因檢測(cè)結(jié)果，建議當(dāng)結(jié)果無(wú)法解釋，即B-A、C-A、D-A均＜5 mm且E＞10 mm，但對(duì)法羅培南耐藥時(shí)也判斷為產(chǎn)KPC酶[8-9]。此補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)將檢測(cè)KPC酶的靈敏度由33.93%提高至87.50%，特異度為99.43%，Youden指數(shù)和Kappa值分別為0.87、0.90，真實(shí)性和一致性較好，判斷其他酶型的靈敏度和特異度不變。MAST D73C檢測(cè)碳青霉烯酶與PCR結(jié)果相比，總符合率為90.91%（210/231）。

3 討論

近年來(lái)CRE檢出不斷增加，成為兒童健康及生命的巨大威脅和挑戰(zhàn)，加上其易播散，已經(jīng)引起全球的廣泛重視[10]。明確碳青霉烯酶類型，有助于臨床及時(shí)選擇合適的抗生素，阻止病原菌進(jìn)一步傳播。2014年產(chǎn)NDM-1酶的肺炎克雷伯菌曾在本院引起克隆播散[11]，本次研究發(fā)現(xiàn)2016-2017年CRE菌株仍以產(chǎn)NDM-1酶為主。NDM-1酶在兒童和成人中檢出均有報(bào)道，但主要在兒童中檢出，由于其廣泛耐藥性導(dǎo)致感染治療十分困難，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。KPC酶在成人分離株中常見(jiàn)，此次研究中兒童分離株也有少數(shù)檢出。值得注意的是，本次研究中肺炎克雷伯菌主要檢出OXA-232，它是OXA-48的一種變異體。OXA-48家族目前在歐洲地區(qū)比較多見(jiàn)，常引起流行播散，國(guó)內(nèi)也陸續(xù)有報(bào)道[12-13]，臨床上應(yīng)及時(shí)監(jiān)測(cè)并采取切實(shí)有效的感控措施阻止其在國(guó)內(nèi)引起大的流行播散。

OXA-48酶由于低碳青霉烯類MIC值常被常規(guī)表型檢測(cè)方法漏檢，目前需要一種可以快速準(zhǔn)確判斷產(chǎn)OXA-48酶菌株的方法。適合在基層微生物室開(kāi)展的碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法主要有改良Hodge試驗(yàn)、 Carba NP試驗(yàn)、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）等[14]。改良Hodge試驗(yàn)和Carba NP試驗(yàn)對(duì)OXA-48酶檢出靈敏度較低，并且無(wú)法區(qū)分碳青霉烯酶型別；mCIM試驗(yàn)檢出碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均大于90%，與EDTA碳青霉烯類失活法（EDTA-carbapenem inactivation method， eCIM） 聯(lián)合僅可區(qū)分絲氨酸碳青霉烯酶和MβL酶，臨床應(yīng)用受限。采用PCR方法擴(kuò)增碳青霉烯酶基因并測(cè)序分析需要2～3 d，許多基層實(shí)驗(yàn)室還不具備開(kāi)展條件，而MAST D73C組合紙片法僅需要18～20 h，并且操作簡(jiǎn)便，通過(guò)測(cè)量5張紙片抑菌圈直徑就能夠判斷該菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶及其類型，尤其是產(chǎn)OXA-48酶菌株。

日本一所大學(xué)醫(yī)學(xué)院認(rèn)為MAST D73C可以有效判斷菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶并可以區(qū)分MβL酶、KPC酶和OXA-48酶[15]，但是本研究中多數(shù)產(chǎn)KPC酶菌株的C-A＜5 mm，結(jié)果無(wú)法判讀，導(dǎo)致檢測(cè)KPC酶的靈敏度較低（33.93%）。Youden指數(shù)和Kappa值顯示MAST D73C紙片組合區(qū)分產(chǎn)MβL和OXA-48酶菌株的真實(shí)性和一致性較好，但不能很好地區(qū)分產(chǎn)KPC酶菌株（Youden指數(shù)0.33，Kappa值0.43），可能是檢測(cè)KPC酶的低靈敏度降低了可靠性。國(guó)內(nèi)產(chǎn)KPC-2酶的腸桿菌科細(xì)菌尤其是肺炎克雷伯菌ST11型對(duì)碳青霉烯類抗生素的MIC值較高（＞32 mg/L），而國(guó)外KPC-2流行克隆型菌株MIC值相對(duì)較低[16]，推測(cè)C組紙片含有的KPC抑制劑濃度不能有效抑制碳青霉烯類高度耐藥菌株中的KPC酶作用。

M A S T D 7 3 C 檢 測(cè)K P C 酶 的 靈 敏 度 低（33.93%）是其重要缺陷。采用基于實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和PCR結(jié)果制定的KPC型碳青霉烯酶補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)后，靈敏度顯著提高，并且不影響其他酶型的靈敏度和特異度，為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)開(kāi)展此種檢測(cè)方法提供參考。另外6株結(jié)果仍無(wú)法解釋的CRE菌株經(jīng)PCR確認(rèn)產(chǎn)OXA-48酶，這也是造成MAST D73C組合紙片檢測(cè)OXA-48類酶的靈敏度不是100%的原因之一。MAST D73C檢測(cè)碳青霉烯酶與PCR結(jié)果相比，總符合率為90.91%，能夠在一定程度上對(duì)碳青霉烯酶型別進(jìn)行區(qū)分。2018年CLSI標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)eCIM檢測(cè)靈敏度＞95%，特異度大于92%[17]。本研究中組合紙片法篩選MβL酶的靈敏度和特異度均高于CLSI標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)產(chǎn)金屬酶的菌株。此前有報(bào)道組合紙片方法可以判斷同時(shí)產(chǎn)OXA-181和NDM-1酶菌株[13]，本研究對(duì)同時(shí)產(chǎn)KPC-2酶和NDM-1酶菌株僅判斷為MβL酶，產(chǎn)KPC-2酶和IMP-4酶菌株僅判斷為KPC酶，發(fā)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)多種碳青霉烯酶菌株的判斷仍存在一定局限性。此外，組合紙片法可以初步判斷產(chǎn)AmpC酶伴膜孔蛋白缺失，本研究中未進(jìn)行驗(yàn)證，仍需進(jìn)一步研究。

目前CRE的治療仍是臨床醫(yī)師面臨的挑戰(zhàn)，臨床極需創(chuàng)新藥物應(yīng)對(duì)碳青霉烯類耐藥性的威脅。日前國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)新型抗生素頭孢他啶-阿維巴坦，用于肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌引起的感染。酶抑制劑阿維巴坦除金屬酶外較已經(jīng)上市的一些復(fù)合制劑中的克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等具有更加好的抑酶譜和抑酶活性，由于其為一非自殺性抑制劑，故抑酶的周期高于上述酶抑制劑[18]。因此，明確碳青霉烯酶型別不僅可以用于流行病學(xué)研究和制定感控策略，也可以更有效地指導(dǎo)臨床用藥。MAST D73C組合紙片法可在一定程度上簡(jiǎn)便快速地判斷碳青霉烯酶型別，有助于臨床更合理地應(yīng)用抗菌藥 物。