肺炎克雷伯菌毒力因子研究進展

宋國濱，徐元宏

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科,安徽 合肥 230022)

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科家族中的一員，可以引起嚴重的器官和生命危險性疾病，在臨床上是一種越來越重要的細菌病原體，因一直處于不斷進化中導致具有一個關鍵特性即容易獲得新的遺傳物質的能力[1]。也正是由于這種能力的存在產生了兩種變異體，分別是經典型肺炎克雷伯菌(classical K. pneumoniae， cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌, 每一種都對臨床醫(yī)生提出了嚴峻的挑戰(zhàn)[2-3]。

隨著目前臨床上侵入性操作越來越多(氣管插管、靜脈留置導管、外科手術等)，患者的感染發(fā)生率也在不斷上升，引起院內感染的肺炎克雷伯菌大部分是cKP，這種病原體已經被證明可以快速傳播產生對抗生素的耐藥性，這使得cKP在屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌病原體中占有一席之地，給臨床抗感染治療帶來了壓力。

與cKP相比，對HvKP的研究不多，自1983年我國臺灣分離并報道的第一例高毒力肺炎克雷伯菌目前在全球范圍內廣泛傳播開來，主要引起社區(qū)獲得性感染，其感染對象可以是任何年齡的健康人，并易向遠處轉移，引起遠處部位的感染(肝膿腫、眼內炎、中樞神經系統(tǒng)炎癥，腹膜炎等)[4]。最初研究者以菌落呈現(xiàn)高黏液性作為篩選HvKP的標志，但是后來的研究證實并非所有的HvKP都表現(xiàn)出該特性，一些cKP也可以表現(xiàn)出高黏液表型[5-6]。然而需要注意的是一些研究證實通過毒力基因可能使檢出率更加準確，其含有的毒力基因眾多，包括莢膜多糖以及促莢膜多糖合成基因(rmpA/ rmpA2基因、MagA基因)、鐵載體系統(tǒng)(腸桿菌素、耶爾森菌素、氣桿菌素、沙門菌素)、菌毛粘附蛋白(Ⅰ型菌毛、Ⅲ型菌毛)，故在下面詳細介紹以上幾種毒力因子。

1 莢膜多糖及促莢膜多糖合成基因

1.1莢膜多糖：肺炎克雷伯菌的莢膜多糖是一種酸性多糖，通常由3～6個糖的重復單位組成，是由Wzy依賴的聚合反應途徑合成的[7]。合成莢膜多糖的基因簇大小在21-30kb之間，約有16～25個相關基因[8-9]。所有已知的肺炎克雷伯菌cps基因簇的5′端區(qū)域包含6個保守基因(按以下順序排列：galF、orf2、wzi、wza、wzb和wzc)，3′端區(qū)域包含1個保守基因gnd，主要終止于ugd基因，而中心區(qū)域則包含1個保守基因gnd，編碼cps亞單位聚合和組裝的蛋白質是高度分化的。wzy和wzi基因存在于所有的K型中，但它們在不同的K型中都具有高度的序列變異性。

因此，建立了wzy靶向PCR方法鑒定K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57[10]，并且wzi測序能夠區(qū)分大多數臨床肺炎克雷伯菌分離株的K型。此外，基于wzc測序的莢膜分型方法已被用于檢測新型肺炎克雷伯菌莢膜類型。莢膜多糖是構成肺炎克雷伯菌莢膜的重要組成成分，也是其毒力強的一個主要因素，主要是可以保護肺炎克雷伯菌免受巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞和樹突狀細胞(DC)的調理和吞噬，抵抗機體免疫細胞對其的殺傷作用，逃避免疫系統(tǒng)對其的識別；另外被中性粒細胞吞噬后在細胞內不被分解，借助細胞向遠處進行轉移，引起遠處部位的感染[11]。由于有這層屏障的存在，抗菌藥物也無法有效地起到殺菌作用，因此是毒力增強的主要因素。

1.2莢膜多糖調節(jié)基因：RmpA/RmpA2基因：質粒攜帶的RmpA及RmpA2基因編碼促進莢膜多糖合成的轉錄激活因子，可以使K1、K2血清型的肺炎克雷伯菌的莢膜多糖快速大量的合成[12-13]，使菌落呈現(xiàn)高黏液表型。除了質粒上能夠攜帶RmpA及RmpA2基因外，細菌的染色體上也可以攜帶，但是只有質粒上攜帶的兩種基因才可以增強莢膜多糖的轉錄過程。

MagA基因：莢膜多糖的合成起始于單個糖重復單元的組裝，這些糖單元由不同的糖基轉移酶按順序進行催化。由此產生的新生重復序列通過flippase Wzx轉移到內膜上，并在周質空間通過Wzy聚合酶進行聚合，在Wza(一種內膜酪氨酸自身激酶)、Wzb(一種蛋白酪氨酸磷酸酶)和Wzc(一種完整的外膜脂蛋白)的聯(lián)合作用下進一步聚合控制和向細菌細胞表面輸出成熟的CPS。magA基因編碼莢膜血清型K1特異性Wzy聚合酶，但在脂多糖(LPS)合成中不起作用[14-16]，只存在于K1血清型的菌株中。有研究表明當magA基因發(fā)生突變后，莢膜多糖的合成量大幅下降，菌株的毒力作用也顯著降低。

2 脂多糖

脂多糖存在于革蘭陰性菌細胞壁中，是細胞壁外壁的組成成分，主要由多糖和脂質構成，同時也是一種可以引起人體發(fā)熱的內毒素。O抗原是脂多糖最外層的一種成分，可以保護細菌免于機體的補體系統(tǒng)對其的殺傷作用，但是與細菌逃避中性粒細胞作用無關。與大腸桿菌和腸沙門氏菌相比，與LPS相關的肺炎克雷伯菌O抗原的分析受到限制。目前為止已經描述了9種O抗原類型[17]，其中O1型是與人類感染相關的最常見血清群?？乖禺愋钥赡苁怯捎趩沃貜蛠喕揎椀淖饔?，例如O2a血清型的O抗原側鏈是雙糖D-半乳糖亞基的聚合物。因此，可知肺炎克雷伯菌的脂多糖和莢膜并不是完全獨立產生的，其中一種結構的形成會影響另一種結構的數量和存在。已在K2血清型中研究了膠囊與脂多糖的關聯(lián)，其中莢膜通過GalA[18]上羧基的負電荷與LPS的離子相互作用而結合。有報道稱，在LPS生物合成中起重要作用的酶會影響肺炎克雷伯菌細胞結合膜的數量。這些結果表明了克雷伯菌這兩種結構在生化和合成水平上的相互關系。

3 鐵載體系統(tǒng)

因為鐵是細菌代謝所必需的輔助因子，肺炎克雷伯菌必須在體內與宿主細胞競爭必需的鐵來完成生命活動。細菌病原體通過合成被稱為鐵載體的小的鐵清除分子來應對哺乳動物宿主體內鐵的缺乏(其中鐵被各種鐵結合蛋白結合)，包括肺炎克雷伯菌在內的腸桿菌科病原體產生一種稱為腸桿菌素(enterobactin)的典型鐵載體，與任何其他已知的鐵螯合劑相比它具有最高的鐵親和力。此外還有氣桿菌素(aerobactin)、耶爾森菌素(yersiniabactin)和沙門菌素(salmochelin)[19]。

氣桿菌素是由檸檬酸分子與N6-羥基乙酰賴氨酸組成的羥肟化合物，由賴氨酸氧化衍生而成[20-21]。耶爾森菌素是一種酚型的鐵載體，而沙門菌素是一種糖基化的腸桿菌素。除了所描述的4種鐵載體外，高毒力肺炎克雷伯菌可能還具有其他多種鐵捕獲系統(tǒng)。以鐵載體為基礎的鐵獲取途徑，允許這種病原體逃避宿主固有免疫的脂蛋白2機制[22]，有文獻報道，曾分離出一種高毒力高黏液性肺炎克雷伯菌，對該菌的毒力基因研究發(fā)現(xiàn)，其產生一種大小約3kd左右的小分子物質，使菌株可以在腹水中生長和存活。初步證據表明，該分子與鐵的吸收有關，是一個鐵載體。研究表明，與毒性較小的肺炎克雷伯菌相比，這些菌株的毒力增強可能部分是由于鐵載體產生增加以及鐵結合活性增加所致[23]。最近的數據表明，HvKP菌株比經典型肺炎克雷伯菌菌株具有產生更多和生物活性更高的鐵捕獲分子的能力，這一機制可能有助于毒力和發(fā)病機制[24],揭示了高毒力肺炎克雷伯菌增加其致病潛能的額外機制，除了鐵載體參與攝取鐵離子外，還存在介導鐵離子進入細菌體內的基因，如tonB基因和kfu基因。由氣桿菌素和沙門菌素攜帶的鐵離子，需要與tonB基因編碼存在細胞膜上的疏水端結合才可以進入細胞，kfu基因編碼的蛋白能夠介導鐵離子的轉運并調節(jié)細菌的毒力。之前的研究表明，kfu基因只存在于莢膜血清型為K1的菌株，但后來的研究表明該基因也可存在于K2血清型的一少部分[25]。

4 菌毛黏附蛋白

肺炎克雷伯菌具有Ⅰ型和Ⅲ型菌毛黏附蛋白，菌毛黏附蛋白有助于細菌黏附人體的上皮細胞和免疫細胞以及非生物表面，是細菌感染機體的首要前提。Ⅰ型菌毛主要參與細胞內細菌群落的形成，Ⅲ型菌毛對于生物和非生物表面的生物膜形成具有重要性。高毒力肺炎克雷伯菌和經典型肺炎克雷伯菌都含有這兩種菌毛黏附基因，在cKP菌株中菌毛蛋白已被證明可以與來自呼吸道和尿道的宿主上皮細胞黏附以此來增加感染[26-27]。盡管對HvKP的研究很少，但一項研究報道了HvKP菌株CG43中Ⅲ型菌毛基因的調節(jié)，該研究證實了Ⅲ型菌毛蛋白參與了生物膜的形成，并證明了其表達與鐵濃度呈正相關，盡管體內毒力沒有被提及，但這些數據表明在游離鐵有限的人類宿主體內Ⅲ型菌毛黏附蛋白起到的作用有限[28]。此外，Lin等的研究表明肺炎克雷伯菌在高濃度的葡萄糖作用下會通過抑制CRP-cAMP的機制促使Ⅲ型菌毛黏附相關基因的表達[29]，因此糖尿病患者更容易被肺炎克雷伯菌引起肝膿腫，可能與此機制有關。

5 總結和展望

肺炎克雷伯菌是一種機會致病性病原體，莢膜多糖的大量合成是毒力增強的重要因素，其他毒力因子包括促莢膜合成基因、鐵載體、菌毛黏附蛋白等。除了毒力因子之外，很多地區(qū)都檢測出攜帶耐藥質粒的高毒力肺炎克雷伯菌[30-31]，這種細菌毒力高，耐藥性強，在臨床工作中應引起重視。

盡管已使用全球性篩選方法(如標記突變基因法)來確定候選毒力的方法，但是當前對肺炎克雷伯氏菌發(fā)病機理的了解主要來自研究單個基因， 在不同類型的肺炎克雷伯菌中可以發(fā)現(xiàn)巨大的遺傳變異性，這可能導致致病性的巨大差異。目前仍然尚不清楚對控制復雜細胞途徑以協(xié)調方式運行的調節(jié)網絡的理解，這使得哺乳動物宿主中的肺炎克雷伯氏菌成為可能?；蚪M學和轉錄組學研究有望從基因組規(guī)模的角度為我們提供對肺炎克雷伯菌-宿主相互作用的更深入了解，并為進一步基于假設的功能表征鑒定毒力相關基因的眾多候選基因。