化療聯(lián)合二甲雙胍治療前后非小細(xì)胞肺癌患者外周血中IGF-1和mTOR表達(dá)變化及其療效分析

李瑞陽,林芷伊,李 晶,費(fèi) 晶,徐 丹，鞏 平

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，新疆 石河子 832000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是近年來發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。隨著環(huán)境及人們生活方式的改變，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢，多數(shù)患者確診時(shí)已到晚期，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，臨床上對(duì)NSCLC患者廣泛采取鉑類為基礎(chǔ)的化療，鉑類化療藥物可以有效延長患者生存時(shí)間，提高患者的生存質(zhì)量，但其不良反應(yīng)發(fā)生率仍居高不下[2]。因此，尋找一種可以提高患者療效及降低鉑類化療藥物對(duì)NSCLC患者的不良反應(yīng)的藥物十分必要。近年來，二甲雙胍治療腫瘤已經(jīng)成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，其在多種腫瘤的治療中均發(fā)揮作用[3-4]。在乳腺癌細(xì)胞系中，二甲雙胍已被證明可誘導(dǎo)胰島素調(diào)節(jié)的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路底物中特定絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過度增殖[5]。LKHAGVADORJ等[6]研究發(fā)現(xiàn)：在腎癌中，胰島素、胰島素樣生長因子 1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)和胰島素樣生長因子 2(insulin-like growth factor 2,IGF-2)同時(shí)觸發(fā)胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和IGF-1受體(IGF-1R)磷酸化，進(jìn)而刺激并觸發(fā)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)-mTOR通路相關(guān)基因下調(diào)。研究[7]顯示：二甲雙胍能改善NSCLC并發(fā)糖尿病患者預(yù)后,但二甲雙胍聯(lián)合鉑類化療對(duì)NSCLC患者的治療效果卻鮮有報(bào)道。本研究旨在探討化療聯(lián)合二甲雙胍治療NSCLC的療效，并探討其潛在的作用機(jī)制，為二甲雙胍用于NSCLC患者的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人IGF-1、mTOR mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Thermo Fisher Scientific有限公司，QuantiNova SYBR Green PCR Kit (500)試劑盒購自德國QIAGEN公司，mTOR試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，IGF-1試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。普通96孔PCR儀購自日本TaKaRa公司，4℃離心機(jī)、96孔板離心震蕩機(jī)和7500 Fast Real-Time PCR system 機(jī)購自德國Therma scientific公司，BIO-TEK全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司

1.2 一般資料 選取2017年11月29日—2018年6月20日經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)為晚期NSCLC患者60例，由醫(yī)生根據(jù)患者病情、結(jié)合患者意見共同商定，選取不同的治療方式，分為化療組和聯(lián)合組，其中30例患者采用單純化療(化療組)，30例患者采用化療聯(lián)合二甲雙胍治療(聯(lián)合組)。化療組30例，其中男性22例，女性8例；年齡32～75歲，中位年齡56歲；吸煙17例，不吸煙13例；腺癌15例，鱗癌15例；Ⅲ期14例，Ⅳ期16例；美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評(píng)分：1分22例，2分8例；中分化21例，低分化9例；周圍型24例，中央型6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移14例；胸腔積液7例，無胸腔積液23例。聯(lián)合組30例，其中男性19例，女性11例；年齡47～74歲，中位年齡58歲；吸煙14例，不吸煙16例；腺癌15例，鱗癌15例；Ⅲ期9例，Ⅳ期21例；ECOG評(píng)分：1分24例，2分6例；中分化12例，低分化18例；周圍型25例，中央型5例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移10例；胸腔積液5例，無胸腔積液25例。2組患者基本資料組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①患者年齡20～75歲；②NSCLC患者的診斷參照人民衛(wèi)生出版社第8版《外科學(xué)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against cancer，UICC)2017年1月頒布實(shí)施的最新版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期；④無糖尿病史；⑤ECOG功能狀態(tài)評(píng)分0～2分；⑥重要臟器功能基本正常；⑦具有影像學(xué)可測量的病灶；⑧病理證實(shí)為鱗癌及無表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變的腺癌。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①具有明顯臨床癥狀的心臟疾病患者，如充血性心衰、癥狀明顯的冠心病、藥物難以控制的心律失常及原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓(血壓高于180/110 mmHg)，或6個(gè)月內(nèi)曾有心肌梗死發(fā)作，或心功能不全的患者；②對(duì)化療方案嚴(yán)重不耐受的患者；③精神障礙者、無法律行為能力者和醫(yī)學(xué)或倫理學(xué)原因影響研究繼續(xù)進(jìn)行者，現(xiàn)有嚴(yán)重肝臟疾病(肝硬化等)、腎臟疾病和呼吸道疾病等慢性系統(tǒng)性疾病患者；④肺結(jié)核患者，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染患者,乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染患者。

1.5 化療方法 腺癌采用培養(yǎng)曲塞聯(lián)合鉑類化療(PP)方案，化療方案為培美曲塞二鈉(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20080210)500 mg·m-2第1天靜脈滴注，順鉑75 mg·m-2第1天靜脈滴注或者注射用卡鉑(0.1 g/瓶，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：7F013B01)血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)5 mg·mL-1·min-1靜脈滴入，每21 d重復(fù)，共治療2個(gè)周期。鱗癌采用吉西他濱聯(lián)合鉑類化療(GP)方案，化療方案為吉西他濱(山西普德藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20183199)1 g·m-2第1天靜脈滴注，順鉑和卡鉑具體用藥方案同腺癌，每21 d重復(fù)，共治療2個(gè)周期。聯(lián)合組患者在上述化療方案的基礎(chǔ)上，于化療第1天開始早飯后服二甲雙胍0.25 g，每天1次，直至第3個(gè)周期化療前1 d停止。所有患者治療前于本院行胸部CT檢查，檢測外周血中IGF-1和mTOR水平及mRNA表達(dá)水平，治療2個(gè)周期后復(fù)查，觀察患者臨床療效及外周血中IGF-1和mTOR水平和mRNA表達(dá)水平的變化。本研究臨床試驗(yàn)注冊(cè)號(hào)ChiCTR-ONN-17014156，經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)：2017-095-02，患者均簽署知情同意書。

1.6 療效評(píng)價(jià) 參照實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版(RECIST 1.1)將近期療效分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)。CR：可見病灶完全消失，維持1個(gè)月以上；PR：腫瘤最大直徑和最大垂直直徑的乘積縮小≥50%；SD：腫瘤最大直徑和最大垂直直徑的乘積縮小<50%，腫瘤最大直徑和最大垂直直徑的乘積增大<25%；PD：患者出現(xiàn)一個(gè)或者多個(gè)病灶的腫瘤最大直徑和最大垂直直徑的乘積增大≥25%?？傆行?(CR+PR+SD)患者例數(shù)/患者總例數(shù)×100%，至少維持4周。

1.7 ELISA法檢測患者外周血中IGF-1和mTOR水平 分別于化療前和化療后抽取患者空腹靜脈血，室溫靜置30 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上層血清凍存于-80℃冰箱，采用ELISA法檢測患者外周血中IGF-1和mTOR水平，各步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QT-PCR)法檢測患者外周血中IGF-1和mTOR mRNA表達(dá)水平 引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)，引物序列見表1。

表1 QT-PCR引物序列Tab.1 Sequences of QT-PCR primers

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，特定引物PCR擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系: 2×SYBR Green Master Cmix 10 μL，無酶水5 μL，上下游引物各1 μL，ROX液2 μL，cDNA1 μL。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性3 min，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、45 s，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)測定2次。數(shù)據(jù)的收集由Stratagene Mx3000P Real time PCR儀自帶軟件完成，采用2-ΔΔCT法計(jì)算IGF-1和mTOR mRNA表達(dá)水平。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 2組患者治療前后外周血中IGF-1和mTOR水平差值 聯(lián)合組患者治療前后外周血中IGF-1和mTOR水平差值明顯低于化療組(P<0.05)，聯(lián)合組腺癌和鱗癌患者治療前后外周血中IGF-1和mTOR水平差值明顯低于化療組(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者治療前后外周血中IGF-1和mTOR水平差值Tab.2 Differences of levels of IGF-1 and mTOR in serum of patients in two groups before and after treatment

ADA：Adenocarcinoma； SCC：Squamous cell carcinoma；*P<0.05vschemotherapy group;△P<0.05vsADA in chemotherapy group;#P<0.05vsSCC in chemotherapy group.

2.2 2組患者治療前后外周血中IGF-1和mTOR mRNA表達(dá)水平差值 聯(lián)合組患者治療前后外周血中IGF-1和mTOR mRNA表達(dá)水平差值明顯低于化療組(P<0.05)，聯(lián)合組腺癌和鱗癌患者治療前后外周血中IGF-1和mTOR mRNA表達(dá)水平差值明顯低于化療組(P<0.05)。見表3。

2.3 2組患者臨床療效的單因素和多因素分析 聯(lián)合組患者中，PR 17例，SD 7例，PD 6例；化療組患者中，PR 12例，SD 4例，PD 14例;聯(lián)合組患者總有效率[80.0%(24/30)]明顯高于化療組[53.3%(16/30)](P<0.05)。2組患者臨床療效單因素分析：性別、吸煙、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與2組患者療效有關(guān)(均P<0.05)，見表4；ECOG評(píng)分和腫瘤分化程度與化療組患者療效有關(guān)(均P<0.05)，見表5；胸腔積液與聯(lián)合組患者療效有關(guān)(P<0.05)，見表6。二分類Logistic回歸分析各因素賦值見表7；多因素分析結(jié)果顯示：吸煙和腫瘤分期是2組患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，吸煙和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是化療組患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，吸煙、腫瘤分化程度和胸腔積液是聯(lián)合組患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見表8。

表3 2組患者治療前后IGF-1和mTOR mRNA表達(dá)水平差值Tab.3 Differences of IGF-1 and mTOR mRNA expression levels of patients in two groups before and after treatment

ADA:Adenocarcinoma； SCC:Squamous cell carcinoma；*P<0.05vschemotherapy group;△P<0.05vsADA in chemotherapy group;#P<0.05vsSCC in chemotherapy group.

表4 2組患者臨床療效單因素分析Tab.4 Univariate analysis on clinical efficacies of patients in two groups

SCC：Squamous cell carcinoma；ADA：Adenocarcinoma.

表5 化療組患者臨床療效單因素分析Tab.5 Univariate analysis on clinical efficacies of patietns in chemotherapy group

SCC：Squamous cell carcinoma；ADA：Adenocarcinoma.

2.4 2組患者不良反應(yīng)發(fā)生率 聯(lián)合組患者骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、腎毒性和肝臟損害的發(fā)生率分別為13.3%、30.0%、6.7%和3.3%，與化療組(分別為10.0%、24.0%、3.3%和6.7%)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

肺癌是全球關(guān)注的健康問題，NSCLC占肺癌的絕大部分，由于NSCLC早期癥狀不明顯，約有75%的患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，喪失了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)，導(dǎo)致NSCLC患者的5年生存率較低[8]。目前，鉑類化療是臨床上治療NSCLC的主要方式，盡管化療藥物可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但是在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損傷正常細(xì)

表6 聯(lián)合組患者臨床療效單因素分析Tab.6 Univariate analysis on clinical efficacies of patients in combination group

SCC：Squamous cell carcinoma；ADA：Adenocarcinoma.

表7 各因素和賦值Tab.7 Various factors and assignment

SCC：Squamous cell carcinoma；ADA：Adenocarcinoma.

胞，同時(shí)也加重患者的不良反應(yīng)，因此尋找一種能提高NSCLC患者療效、不良反應(yīng)輕微的治療方法十分重要。IGF-1是一種多功能蛋白肽，在肺癌細(xì)胞生長、增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用[9]，mTOR是PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路上的關(guān)鍵因子，對(duì)惡性腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥具有重要的影響，其作用主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成[10]。二甲雙胍是一種常見降糖藥，其主要作用是降低細(xì)胞能量狀態(tài)，從而激活細(xì)胞代謝傳感器AMPK，致使胰島素和IGF-1的血清濃度下降，而IGF-1是癌細(xì)胞的強(qiáng)力有絲分裂原，二甲雙胍還可能通過直接抑制mTOR的表達(dá)，抑制相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)和合成代謝過程[11]。本研究中聯(lián)合組患者治療后血清中IGF-1和mTOR水平明顯低于化療組，提示二甲雙胍可

表8 2組患者臨床療效獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析Tab.8 Analysis on independent risk factors of clinical efficacies of patients in two groups

能通過降低IGF-1和mTOR的表達(dá)來抑制腫瘤的生長。

本研究在常規(guī)化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合二甲雙胍對(duì)NSCLC患者進(jìn)行治療，結(jié)果顯示：聯(lián)合組患者的總有效率(80.0%)明顯高于化療組(53.3%)，提示在常規(guī)化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合二甲雙胍可能對(duì)NSCLC患者具有更好的治療效果。一項(xiàng)255例NSCLC并發(fā)糖尿病的患者研究[12]證實(shí)：二甲雙胍能提高患者的總生存期和無病進(jìn)展生存期，本研究結(jié)果與之相近，但本研究對(duì)象為NSCLC非糖尿病患者，研究樣本量較少，后續(xù)工作中應(yīng)積累更多的樣本資料，進(jìn)一步證實(shí)本研究的結(jié)論。

本研究中，單因素分析結(jié)果顯示：性別、吸煙、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與2組患者療效有關(guān),ECOG評(píng)分和分化程度與化療組患者療效有關(guān)，胸腔積液與聯(lián)合組患者療效有關(guān)；多因素分析結(jié)果顯示：吸煙和腫瘤分期是2組患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，吸煙和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是化療組患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，吸煙、腫瘤分化程度和胸腔積液是聯(lián)合組患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。關(guān)于性別與NSCLC之間的關(guān)系，不同學(xué)者有不同看法，LUND-IVERSEN等[13]報(bào)道：性別對(duì)NSCLC患者治療效果有影響，考慮與雌激素的保護(hù)作用有關(guān)。本研究中其他各項(xiàng)指標(biāo)是否為NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因素與相關(guān)研究[14-16]結(jié)果一致。吸煙是眾所周知的誘發(fā)肺部病變及影響療效的因素[17]，NSCLC的高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率與腫瘤分化程度有密切關(guān)聯(lián)，這也對(duì)治療產(chǎn)生了一定的影響[18]，與本研究結(jié)果中NSCLC分化程度是聯(lián)合組患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素一致。胸腔積液是NSCLC常見的并發(fā)癥，其直接影響患者的療效及預(yù)后[19]。但是影響NSCLC療效的因素很多，仍需要大量臨床研究來探尋NSCLC的病因。

鉑類藥物的不良反應(yīng)主要為骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、腎毒性和肝臟毒性，聯(lián)合組患者骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、腎毒性和肝臟損害的發(fā)生率與化療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且患者均未出現(xiàn)低血糖表現(xiàn)，可見二甲雙胍與鉑類聯(lián)合化療方案與單純鉑類化療方案的不良反應(yīng)相當(dāng)，不會(huì)增加藥物毒性和不良反應(yīng)，患者均可耐受。一項(xiàng)針對(duì)卵巢癌的研究[20]顯示：mTOR通路在鉑類化療藥物的耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用。研究[21-22]發(fā)現(xiàn)：順鉑與IGF-1結(jié)合，會(huì)加速IGF-1的斷裂，抑制蛋白質(zhì)的合成。結(jié)合本研究聯(lián)合組患者血清IGF-1和mTOR水平明顯低于常規(guī)化療組，提示二甲雙胍可能通過降低IGF-1和mTOR水平，延緩鉑類化療藥物的耐藥，增加了NSCLC的療效。

綜上所述，化療聯(lián)合二甲雙胍治療NSCLC患者的效果較好，且能降低其不良反應(yīng)發(fā)生率，其機(jī)制可能與降低患者血液中IGF-1和mTOR水平有關(guān)。