表兒茶素對四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的干預(yù)作用

王玉涵，展 凡，程 卉，鄭 鳳，謝忠穩(wěn)，李慶林

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物資源與利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230031)

肝纖維化是對慢性肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，是大多數(shù)慢性肝病的一個主要特征，反映了肝臟修復(fù)與瘢痕形成之間的平衡[1]。隨著損傷時間的延長，肝纖維化可發(fā)展為過度瘢痕和器官衰竭，如肝硬化和原發(fā)性肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。在此過程中，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成增加，降解減少而使得ECM過度沉積；肝纖維化中多種細(xì)胞類型被認(rèn)為是ECM的來源，而肝星狀細(xì)胞是肝損傷后產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞。目前為止，雖然治療肝纖維化的藥物種類繁多[3]，但大多數(shù)藥物的不良反應(yīng)大，治療效果不理想。近年來，中藥治療肝纖維化成為研究的熱點[4-5]。表兒茶素屬黃烷醇類化合物，廣泛存在于茶葉、可可、葡萄等植物中，也可見于多種中藥如兒茶、山楂、何首烏、鉤藤[6-8]。大量研究表明，表兒茶素具有抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[9-11]。Cheng H等[12]研究表明，表兒茶素對非酒精性脂肪肝具有明顯的預(yù)防作用。但是表兒茶素干預(yù)肝纖維化的作用及其機(jī)制目前尚未見研究報道。本研究通過腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纖維化模型，觀察表兒茶素對大鼠肝纖維化的影響，為表兒茶素的應(yīng)用提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011]。

1.2 藥物與試劑 表兒茶素(純度>98.0%，C15H14O6,MW=290.27)：南京植佰萃生物科技有限公司；陽性對照藥為秋水仙堿(批號 20150312)、CCl4(批號 20181010)：北京國藥集團(tuán)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(批號 20181222)、Masson染色試劑盒(批號 201910103)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)檢測試劑盒(批號 20190111)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒(批號 20190112)：南京建成生物工程研究所；平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)抗體(E-AB-34268)、Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen，collα1)抗體(E-AB-70008)：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 低速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀：美國MD公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國ProteinSimple；電子精密天平：奧多利斯科學(xué)儀器有限公司；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

2 方法

2.1 動物模型的復(fù)制、分組及給藥 根據(jù)馬冬梅等[13]的方法復(fù)制肝纖維化大鼠模型。雄性SD大鼠80只，SPF級。實驗室飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組、模型組(CCl4)、秋水仙堿組(CCl4+秋水仙堿)、表兒茶素高劑量組、表兒茶素低劑量組，組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。正常對照組10只，其余每組14只，除正常對照組腹腔注射橄欖油溶液外，其余各組大鼠腹腔注射30% CCl4橄欖油復(fù)制肝纖維化模型，首次3 mL/kg，以后每次2 mL/kg，每周2次，連續(xù)6周，直至動物處死前一天。模型復(fù)制次日開始灌胃給藥，秋水仙堿組按照每日0.1 mg/kg的劑量給予秋水仙堿；表兒茶素高劑量組按照每日100 mg/kg的劑量灌胃給予表兒茶素；表兒茶素低劑量組按照每日25 mg/kg的劑量灌胃給予表兒茶素；正常對照組和模型組給予同容積生理鹽水，每日1次，持續(xù)6周，末次給藥后禁食不禁水24 h，大鼠麻醉后腹主動脈取血，離心分離血清，-20 ℃保存。各組大鼠處死后取肝臟，稱量肝濕質(zhì)量，切取肝左葉邊緣相同部位置于10%甲醛溶液固定，用作組織病理學(xué)觀察，另一部分于-80 ℃保存。

2.2 計算肝臟指數(shù) 肝臟指數(shù)計算公式：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

2.3 血清ALT和AST水平測定 離心分離血清，按照ALT及AST試劑盒上說明，微板法檢測大鼠血清中ALT及AST含量，評價大鼠肝功能。

2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 用10%中性甲醛固定肝臟后，經(jīng)梯度濃度乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明，石蠟包埋、切成4 μm厚的病理組織片后，常規(guī)HE染色，評價肝組織病理學(xué)狀態(tài)。Masson染色，觀察肝臟纖維化程度。

2.5 Western blot法檢測肝臟中α-SMA、collα1蛋白的表達(dá)水平 將肝組織切成小塊,在冰上用放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液提取蛋白。在4 ℃以12 000 r/min離心樣品10 min。通過聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒測量總蛋白質(zhì)的濃度。通過十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離肝組織裂解物樣品，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)上。在一抗(1∶1 000)與4 ℃溫育過夜后，將膜洗滌3次,然后與二抗溫育2 h。通過三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液和吐溫(tris-buffered saline and tween 20，TBST)將膜洗滌3次并分析定量。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 表兒茶素對肝纖維化大鼠肝臟指數(shù)的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，表兒茶素各劑量組、秋水仙堿組大鼠的肝臟指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但表兒茶素各劑量組與秋水仙堿組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示表兒茶素具有改善肝臟指數(shù)的作用。見圖1。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.秋水仙堿組；D.表兒茶素高劑量組；E.表兒茶素低劑量組；與正常對照組比較，#P<0.05，與模型組比較，*P<0.05

3.2 表兒茶素對大鼠肝功能的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠血清中ALT和AST活性顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，表兒茶素各劑量組、秋水仙堿組大鼠血清中ALT和AST的水平顯著降低(P<0.05)，但表兒茶素各劑量組與秋水仙堿組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示表兒茶素具有改善大鼠肝功能的作用。見圖2。

3.3 表兒茶素對肝組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果(見圖3)顯示：正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索排列整齊，呈放射狀排列，肝細(xì)胞大小均勻，無炎癥細(xì)胞變性及壞死。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變，可見明顯壞死的肝細(xì)胞及大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝匯管區(qū)出現(xiàn)膠原纖維沉積。秋水仙堿組和表兒茶素高、低劑量組大鼠肝細(xì)胞損傷程度均有明顯減輕，且秋水仙堿組和表兒茶素高劑量組效果較好，肝細(xì)胞脂肪變性及壞死顯著減少，細(xì)胞炎癥明顯減輕。Masson染色結(jié)果(見圖4)顯示，正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，僅在中央靜脈及匯管區(qū)有極少量膠原纖維存在。模型組大鼠肝臟匯管區(qū)有大量粗大的膠原纖維增生，呈寬帶狀增生的膠原纖維形成條索狀纖維分隔，導(dǎo)致正常的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，形成了假小葉。秋水仙堿組及表兒茶素高、低劑量組肝組織中膠原纖維顯著減少，肝小葉結(jié)構(gòu)也有不同程度的恢復(fù)，且秋水仙堿組和表兒茶素高劑量組恢復(fù)較為顯著。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.秋水仙堿組；D.表兒茶素高劑量組；E.表兒茶素低劑量組；與正常對照組比較，#P<0.05，與模型組比較，*P<0.05

注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組

圖3各組大鼠肝組織形態(tài)變化(HE染色，10×40倍)

3.4 表兒茶素對大鼠肝臟中α-SMA、collα1蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，表兒茶素高、低劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，與秋水仙堿組比較，表兒茶素低劑量組大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達(dá)量顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而表兒茶素高劑量組與秋水仙堿組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示表兒茶素能夠降低大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達(dá)水平，且表兒茶素高劑量組的效果較明顯。見圖5、圖6。

注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組

圖4各組大鼠肝組織形態(tài)變化(Masson染色，10×40倍)

注：A.正常對照組；B.模型組；C.秋水仙堿組；D.表兒茶素高劑量組；E.表兒茶素低劑量組

圖5Westernblot法檢測肝臟中α-SMA、

collα1蛋白表達(dá)水平

注：A.正常對照組；B.模型組；C.秋水仙堿組；D.表兒茶素高劑量組；E.表兒茶素低劑量組；與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與秋水仙堿組比較，◇P<0.05

4 討論

肝纖維化是機(jī)體對各種致病因子引起肝臟持續(xù)性損傷后，肝組織自我修復(fù)的代償反應(yīng)，是各種慢性肝病的共同病理過程，也是向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[14]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，在肝纖維化早期進(jìn)行干預(yù)，可延緩肝纖維化進(jìn)程，減輕肝纖維化程度；若得不到有效治療，肝纖維化最終會發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康。

CCl4是一種經(jīng)典的肝毒性試劑，常被用來誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，具有重復(fù)性好、操作簡單的特點。CCl4進(jìn)入肝細(xì)胞后，可直接被肝細(xì)胞膜溶解，并在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過肝細(xì)胞中細(xì)胞色素P450酶代謝為活潑的自由基后，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[15]。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時，肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出，存在于胞質(zhì)內(nèi)的ALT、AST被釋放進(jìn)入血液，因此，血清中ALT、AST的水平可作為評估肝臟受損傷的程度[16]。本研究表明，模型組大鼠血清ALT、AST水平顯著高于正常對照組，而表兒茶素組大鼠血清ALT、AST水平顯著低于模型組，表明表兒茶素可明顯改善大鼠肝功能。病理學(xué)檢測結(jié)果也顯示，表兒茶素能夠抑制膠原纖維的生成和沉積，對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有明顯的保護(hù)作用。

肝纖維化一個最顯著的特征就是ECM的過度沉積，特別是α-SMA和collα1[17-18]。當(dāng)肝臟受到持續(xù)性損傷時，肝星狀細(xì)胞經(jīng)歷了一個從靜息狀態(tài)的儲脂細(xì)胞到具有高度分化和合成更多的α-SMA、collα1等ECM的肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[19-20]。α-SMA也被認(rèn)為是肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志，在正常情況下，α-SMA僅在血管壁表達(dá)，發(fā)生肝纖維化時，α-SMA表達(dá)明顯增加，在假小葉及纖維縱隔內(nèi)有大量表達(dá)。通過測定肝臟組織中α-SMA、collα1蛋白的表達(dá)，可以從分子水平揭示肝纖維化的形成過程。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織中α-SMA和collα1蛋白表達(dá)水平明顯升高，導(dǎo)致ECM過度沉積，形成肝纖維化；經(jīng)過表兒茶素干預(yù)后的大鼠，其肝組織中α-SMA和collα1蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明表兒茶素可能通過抑制α-SMA和collα1的表達(dá)干預(yù)肝纖維化的進(jìn)程。

綜上所述，本研究初步表明，表兒茶素對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有顯著的改善作用，其作用機(jī)制可能與抑制α-SMA和collα1有關(guān)。