糖通飲對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺組織PI3K-AKT通路的影響*

馬歡， 高楠楠， 陳俞如， 肖瑛,2， 潘艷伶,3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院， 貴州 貴陽 550004)

全世界有超過4.15億人患有糖尿病，據(jù)估計(jì)到2040年發(fā)病率將增加到6.42億[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種常見的糖尿病類型，是一類以胰島素分泌缺乏和(或)機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的常見內(nèi)分泌代謝性疾病[2]，占全球糖尿病病例的90%～95%[3]。T2DM的主要并發(fā)癥包括糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、心血管疾病及肥胖[4-5]，目前臨床應(yīng)用的主要藥物是胰島素及其分析物(磺酰脲類、格列奈類、雙胍類及葡萄糖苷酶抑制劑等)，盡管這些藥物能有效的起到降血糖作用，但也存在肝毒性、腎毒性及低血糖反應(yīng)等各種副作用[6]。有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路異常是T2DM發(fā)生的重要原因[7]，本課題組在臨床及前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)經(jīng)驗(yàn)方“糖通飲”可有效降低T2DM患者或T2DM大鼠的空腹血糖(FBG)[8-10]，本研究通過觀察大鼠胰腺組織中PI3K-AKT信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)因子AKT和胰島素受體底物1(insulin receptor substrate，IRS-1)的變化，同時(shí)檢測(cè)大鼠體質(zhì)量和空腹血糖(FBG)，探討糖通飲的降糖機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(軍)2012-0011；大鼠飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，自由攝水?dāng)z食，室溫22～26 ℃，濕度40%～60%。

1.1.2藥物與試劑 糖通飲(方藥組成為生地黃12 g、山藥15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、澤瀉9 g、丹皮10 g、黃芪15 g、丹參15 g、地骨皮15 g及草決明15 g)由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，鏈脲佐菌素(STZ，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)615K0321)、兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K187913H)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)AI40772A)。

1.2 方法

1.2.1T2DM模型制備 50只SPF級(jí)SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將空腹體質(zhì)量值由高到低排列，采用隨機(jī)數(shù)字表法，分取大鼠10只作為對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)、其余40只給予高脂飼料(普通飼料58%、精煉豬油20%、糖20%及膽固醇2%，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房提供)喂養(yǎng)8周(造模誘發(fā)IR)；2組大鼠禁食不禁水12 h，稱取體質(zhì)量后，造模組大鼠給予1%STZ的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)按20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg腹腔注射、共3次，對(duì)照組則注射相應(yīng)劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；注射72 h后尾靜脈采靜脈血檢測(cè)大鼠餐后隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L[11]，且尿量和飲水量明顯增多者為T2DM成模大鼠。

1.2.2分組與干預(yù)方法 將40只糖尿病成模大鼠按餐后隨機(jī)血糖由高到低排序，采用隨機(jī)數(shù)字表法，分為模型組，糖通飲低、中、高劑量組各10只，分別給予糖通飲水煎劑10、20及30 mg/kg灌胃，對(duì)照組與模型組給予等體積雙蒸水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃8周。實(shí)驗(yàn)過程中，因灌胃或大鼠高血糖等原因死亡7只，其中模型組、低劑量組及中劑量組各2只，高劑量組1只。

1.2.3標(biāo)本采集 給藥8周時(shí)，所有大鼠禁食不禁水12 h，稱取體質(zhì)量，尾靜脈采血，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定FBG；腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠后處死，快速開腹摘除胰腺組織分別置于-80 ℃冰箱和4%多聚甲醛中，以備檢測(cè)胰腺組織中PI3K-AKT通路相關(guān)因子AKT、IRS-1 mRNA與蛋白的表達(dá)。

1.2.4大鼠胰腺組織中AKT、IRS-1 mRNA的表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法，提取胰腺組織總RNA(離心柱型動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒)，驗(yàn)證RNA純度，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；按照qPCR試劑盒操作說明書配置反應(yīng)體系，在qPCR儀以3步法進(jìn)行PCR反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)后采集熒光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，見表1。采用熒光定量PCR相對(duì)定量分析法2-ΔΔCT法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequence of PCR primers

1.2.5胰腺組織中AKT和IRS-1蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，取固定好的石蠟切片(5 μm)常規(guī)脫蠟至水，滴加3%的雙氧去離子水、抗原熱修復(fù)、滴加正常山羊血清封閉液，勿洗。滴加AKT和IRS-1一抗(1 ∶150)，4 ℃冰箱過夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染脫水透明中性樹膠封片，鏡檢，觀察AKT和IRS-1蛋白陽性表達(dá)，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的淡黃色至棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)目越多，蛋白表達(dá)量越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量

干預(yù)前，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠體質(zhì)量均無明顯差異(P>0.05)；給藥2周和4周時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，糖通飲低、中劑量組有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥8周時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠體質(zhì)量均顯著升高(P<0.01)，各劑量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 圖1 糖通飲對(duì)各組大鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of Tangtongyin formula on body mass of rats

2.2 FGB

給藥前，與對(duì)照組比較，模型組大鼠FGB明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠FGB差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥8周時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠FGB明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠FGB明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各劑量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠給藥前后FBG水平的比較Tab.2 Fasting blood glucose before and after drug intervention in rats in each

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。

2.3 大鼠胰腺組織AKT及IRS-1 mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組大鼠胰腺組織AKT及IRS-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲高劑量組大鼠胰腺組織AKTmRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，糖通飲低、中劑量組有上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，糖通飲中、高劑量組大鼠胰腺組織IRS-1 mRNA均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，糖通飲低劑量組有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 圖2 糖通飲對(duì)大鼠胰腺組織AKT及IRS-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Tangtongyin on AKT and IRS-1 signal molecule mRNA in rat pancreas

2.4 大鼠胰腺組織AKT及IRS-1蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組大鼠胰腺組織AKT、IRS-1蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，糖通飲高劑量組大鼠胰腺組織AKT蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，糖通飲低、中劑量組有上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠胰腺組織IRS-1 的蛋白表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但各劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，B為AKT蛋白直條圖，C為IRS-1蛋白直條圖；(1)與對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。 圖3 糖通飲對(duì)T2DM大鼠胰腺組織AKT、IRS-1蛋白表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué)，×400)Fig.3 Effect of Tangtongyin on AKT and IRS-1protein expression in pancreatic tissues of rats with T2DM(immunohistochemistry，×400)

3 討論

IR是指胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的能力下降，IR的發(fā)生可引起糖代謝紊亂[12]。在T2DM患者中，IR的發(fā)生率超過80%，因此，改善T2DM患者的IR狀態(tài)是治療T2DM的有效途徑[13]。全國(guó)名老中醫(yī)凌湘力教授創(chuàng)制的經(jīng)驗(yàn)方“糖通飲”是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上換熟地黃為生地黃，并配伍了黃芪、丹參、地骨皮和草決明，該方根據(jù)T2DM氣陰兩虛為本、瘀血阻絡(luò)為標(biāo)的基本病機(jī)特點(diǎn)創(chuàng)制而成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀的功效[10]。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，黃芪中的黃芪多糖是天然的血糖調(diào)節(jié)劑，具有降糖的作用[14]；丹參可降脂降壓[15]，地骨皮、草決明可促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，有降低血糖的作用[16]。此方在臨床治療T2DM的運(yùn)用中也取得頗為滿意的成果。本研究結(jié)果顯示，糖通飲可明顯降低T2DM大鼠FBG值，提示糖通飲可以改善大鼠的高糖狀態(tài)；糖尿病模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低，可能是由于IR，從而使外周靶組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂肪作為能量物質(zhì)加速分解，促使體質(zhì)量減輕，糖通飲可增加T2DM大鼠的體質(zhì)量，此作用可能與改善IR有關(guān)。

PI3K-AKT信號(hào)通路是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，也是調(diào)控血糖的主要信號(hào)通路[10]。正常的胰島素PI3K-AKT信號(hào)通路不僅可減輕IR，還可以促進(jìn)外周靶組織攝取葡萄糖，對(duì)胰島β細(xì)胞分泌胰島素具有重要作用[17]。當(dāng)此通路上任何一個(gè)因子含量或代謝、分布發(fā)生異常都可能導(dǎo)致體內(nèi)IR的形成，最終誘發(fā)T2DM。PI3K-AKT信號(hào)通路通過相關(guān)因子IRS-1和AKT來調(diào)節(jié)胰島素在體內(nèi)的代謝，可保持血糖的平穩(wěn)。IRS-1是胰島素受體后水平的關(guān)鍵分子，介導(dǎo)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，其表達(dá)量和磷酸化水平是胰島素正常產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵[18]。IRS-1上絲氨酸磷酸化可以負(fù)反饋抑制IRS-1的活性，與IR的發(fā)生有密切關(guān)系[19]。AKT是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中重要的下游分子，以磷酸化形式被活化，活化的AKT可促進(jìn)機(jī)體糖原合成和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，降低血糖水平，是使胰島素最終發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵分子[20]。T2DM由于胰島素受體表達(dá)水平下降，使IRS-1酪氨酸磷酸化水平降低，干擾了PI3K的活化，也因此影響了AKT的活化，從而使胰島β細(xì)胞受損，凋亡增加，胰島素分泌水平下降，出現(xiàn)血糖升高以及T2DM的一系列表現(xiàn)[21]。激活PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可減輕IR和胰島β細(xì)胞的損傷，對(duì)胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用[19]。糖通飲干預(yù)后T2DM大鼠胰腺組織AKT、IRS-1 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著升高，表明糖通飲可能通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路，從而減輕胰島β細(xì)胞損傷和改善IR。

綜上，本研究表明，糖通飲可改善高脂飼料聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的T2DM大鼠胰腺損傷，增加T2DM大鼠體質(zhì)量、緩解FBG的升高，還可通過上調(diào)胰腺PI3K-AKT信號(hào)通路相關(guān)因子IRS-1、AKT mRNA和蛋白的表達(dá)，激活大鼠胰腺PI3K-AKT信號(hào)通路，從而延緩胰島β細(xì)胞功能衰退，保護(hù)胰島β細(xì)胞，改善IR，降低血糖。本研究還發(fā)現(xiàn)，高劑量組的糖通飲治療T2DM的療效最佳，為優(yōu)化臨床用藥劑量的選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。