高通量測序技術(shù)在厭氧菌感染診斷中的作用

周 圍，史偉峰，吳玉敏，王玉月

（蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，江蘇 常州 213000）

感染性休克是患者多臟器感染導(dǎo)致器官功能受損的臨床綜合征，發(fā)病率和病死率較高[1]。采用下一代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）對感染樣本進(jìn)行高通量測序，可較為全面、客觀地獲得疑似致病微生物的屬乃至種的信息，為危重感染患者提供快速、精準(zhǔn)的診斷依據(jù)。有統(tǒng)計結(jié)果表明，從感染性休克的出現(xiàn)到抗菌藥物使用的間隔時間越長，患者病死率越高[2]。因此，越快明確致病菌，越能顯著提高重癥感染患者的生存率。

厭氧菌感染是引起感染性休克的主要原因之一[1，3]，厭氧菌感染患者常出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比增高，但常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果常常為陰性，給臨床確診感染病原菌帶來困難。本研究通過分析2例診斷明確的感染性休克病例，探討NGS在厭氧菌感染診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年3月蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的2例厭氧菌感染性休克患者臨床資料。

1.1.1 病例1 男，49歲，因“右腰部腫痛伴發(fā)熱4 d，意識淡漠0.5 d”入院?；颊呷朐呵?周因右腰部扭傷后進(jìn)行針灸、推拿及藥膏敷貼等治療，3 d后出現(xiàn)腰部脹痛伴發(fā)熱，體溫最高38.4℃，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療（具體不詳）后，癥狀加重轉(zhuǎn)入蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院。體格檢查：體溫38.3℃，脈搏131次/min，呼吸41次/min，血壓18.35/10.24 kPa（138/77 mmHg）（去甲腎上腺素持續(xù)泵入），神志淡漠，精神萎，反應(yīng)遲鈍，全身大汗，右側(cè)頸部、腋下皮膚捻發(fā)感，右側(cè)腰部紅腫，壓痛明顯，局部皮溫高。右肺呼吸音偏低，未及明顯干、濕啰音，心臟、腹部無異常。實驗室檢查：白細(xì)胞計數(shù)9.10×109/L，中性粒細(xì)胞百分比86.4%，乳酸5.6 mmol/L。胸腹部電子計算機(jī)斷層掃描：兩側(cè)慢性支氣管炎、肺氣腫改變伴右肺下葉感染（圖1），兩側(cè)頸部、右側(cè)胸部、右側(cè)腰部、腋窩及背部多發(fā)皮下氣腫，縱膈氣腫。診斷為感染性休克、蜂窩組織炎。

1.1.2 病例2 男，85歲，因“右下肢疼痛超過10 d，加重伴胸悶1 d”入院?；颊?0 d前出現(xiàn)右下肢疼痛，不伴紅腫和畏寒發(fā)熱，至蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕科就診，予口服“美洛昔康”止痛無好轉(zhuǎn)。于入院3 d前右下肢疼痛加劇，逐漸出現(xiàn)四肢浮腫，后胸悶氣急加重，全身大汗，伴言語不清。體格檢查：體溫35.7℃，脈搏118次/min，呼吸40次/min，血壓19.55/11.04 kPa（147/83 mmHg）?；颊呱裰镜裎?，兩側(cè)肺未及明顯干、濕啰音，心臟、腹部無異常，右下肢及右側(cè)腹股溝腫脹，皮膚發(fā)紫。實驗室檢查：白細(xì)胞計數(shù)9.66×109/L，中性粒細(xì)胞百分比91.3%，乳酸12.5 mmol/L。胸腹部電子計算機(jī)斷層掃描：兩側(cè)慢性支氣管炎、肺氣腫改變。肝臟多發(fā)低密度灶；右側(cè)下肢軟組織腫脹伴積氣。診斷為感染性休克、肝膿腫、右下肢皮膚軟組織感染。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定

采集患者雙側(cè)靜脈血，分別接種于血培養(yǎng)瓶（美國BD公司），接種量10 mL/瓶，置FX200血培養(yǎng)儀（美國BD公司）孵育。血培養(yǎng)瓶報陽后，分別轉(zhuǎn)種至血平板、巧克力平板和麥康凱平板（法國科瑪嘉公司），后于35℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，待長出菌落后，采用PhoenixTM-100全自動細(xì)菌鑒定儀及配套鑒定卡（美國BD公司）、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）儀（德國Bruker公司）進(jìn)行菌種鑒定。

將患者導(dǎo)管血、胸腔積液和傷口分泌物樣本分別接種于血平板、巧克力平板和麥康凱平板，置于35℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，待長出菌落后，進(jìn)行菌種鑒定。（1）PhoenixTM-100全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定。用無菌棉簽挑取菌落，將其濃度調(diào)制為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，按儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)菌鑒定。（2）MALDI-TOF MS儀鑒定。用無菌棉簽挑取菌落，點在靶板上，干燥后表面加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸（美國Sigma Aldrich公司），室溫干燥，進(jìn)樣至MALDI-TOF MS儀進(jìn)行檢測。參數(shù)設(shè)置：線性，正離子，蛋白峰譜質(zhì)荷比范圍為2000～20000，激光解析每孔100次。與Biotyper 3.0系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得出鑒定結(jié)果。（3）涂片直接鑒定。取100 μL全血、血培養(yǎng)菌液、傷口分泌物、膿液及胸腔積液，分別均勻涂布于干凈的載玻片上，待干燥后進(jìn)行革蘭染色，鏡檢觀察。

1.3 NGS測序

1.3.1 樣本處理和DNA提取 收集患者300 μL血漿或2 mL胸腔積液、傷口分泌物，采用TIANamp Micro DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按照說明書要求提取基因組DNA。

1.3.2 文庫構(gòu)建和測序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer（美國Agilent公司）質(zhì)控文庫插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit（美國Thermo Fisher Scientific公司）質(zhì)控DNA文庫濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNA納米球。將制備好的DNA納米球加載到測序芯片，送華大基因公司進(jìn)行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 去除低質(zhì)量和長度＜35 bp的數(shù)據(jù)獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過比對BWA（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）去除人基因組序列。余下數(shù)據(jù)去除低復(fù)雜度序列讀數(shù)后與華大基因微生物大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并將比對后的數(shù)據(jù)按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等進(jìn)行分類和排列。NGS對臨床樣本中微生物核酸的最低檢出限為100～1000 拷貝/mL，一般5～10個序列數(shù)對應(yīng)100 拷貝/mL[4]，核酸拷貝數(shù)也是判斷樣本中檢出微生物是否為致病菌最重要的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 病例1檢測結(jié)果

采集病例13月7日入院時靜脈血，直接涂片并革蘭染色，找到陽性球菌，血培養(yǎng)5 d內(nèi)均檢出細(xì)菌生長；3月8日分別采集其穿刺液、胸腹水、傷口膿液直接涂片并革蘭染色，找到陽性球菌和陰性桿菌；樣本培養(yǎng)后經(jīng)Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀和MALDI-TOF MS儀鑒定為星座鏈球菌，根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果調(diào)整抗菌藥物用藥方案；3月11日采集患者全血、傷口分泌物和胸腔積液分別進(jìn)行NGS測序，傷口分泌物樣本中檢出口普氏菌、坦納擬普雷沃菌和沃氏嗜膽菌，檢出序列數(shù)為分別為20610、5317和5016，胸腔積液樣本中檢出口普氏菌、坦納擬普雷沃菌和星座鏈球菌，檢出序列數(shù)分別為196696、95770和3357；全血樣本中只檢出坦納擬普雷沃菌和伯克霍爾德菌，檢出序列數(shù)分別為16和18。

2.2 病例2檢測結(jié)果

采集病例23月26日入院時導(dǎo)管血，直接涂片染色，發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌。導(dǎo)管血培養(yǎng)：需氧瓶、厭氧瓶分別于3 h和2 h檢出細(xì)菌生長；3月26日采集患者靜脈血行雙側(cè)雙瓶血培養(yǎng)，導(dǎo)管側(cè)血培養(yǎng)瓶檢出細(xì)菌生長，無導(dǎo)管側(cè)血培養(yǎng)瓶5 d內(nèi)無細(xì)菌生長，血培養(yǎng)涂片和穿刺液直接涂片革蘭染色發(fā)現(xiàn)陰性桿菌，經(jīng)鑒定為大腸埃希菌；3月26日采集患者傷口分泌物和膿液，培養(yǎng)后分別檢出星座鏈球菌和大腸埃希菌；3月27日，無菌采集患者全血和傷口分泌物行NGS測序，傷口分泌物樣本中檢出多形擬桿菌、不解糖卟啉單胞菌和星座鏈球菌，檢出序列數(shù)分別為210616、156830和34637；血液樣本中檢出唾液乳酸桿菌和小韋榮球菌，檢出序列數(shù)分別為401和18。

3 討論

2例患者均為重癥醫(yī)學(xué)科感染性休克患者，入院期間在接受常規(guī)微生物培養(yǎng)及檢測的同時，采用NGS進(jìn)行感染性微生物檢測，且最終根據(jù)NGS檢測結(jié)果確診為厭氧菌感染。NGS檢測結(jié)果表明，病例1主要以口普氏菌和坦納擬普雷沃菌等感染為主，這2種微生物為條件致病的革蘭陰性專性厭氧菌[5]，推測與患者穿刺液和膿液首次涂片時發(fā)現(xiàn)的革蘭陰性桿菌一致。比較患者各臨床樣本中高通量測序檢出的微生物種類，發(fā)現(xiàn)患者的傷口分泌物與胸腔積液中的微生物種類及豐度極其相似，基本可以確定引起患者肺部感染的病原菌主要來源于其右腰部膿腫。病例2導(dǎo)管血培養(yǎng)和外周靜脈血培養(yǎng)檢出大腸埃希菌的藥物敏感性試驗結(jié)果完全一致，結(jié)合患者雙側(cè)雙瓶血培養(yǎng)結(jié)果不一致的情況，推測患者血培養(yǎng)檢出的大腸埃希菌可能為導(dǎo)管相關(guān)性感染[6]?；颊呷狽GS檢測并未檢出大腸埃希菌，也進(jìn)一步驗證了上述假設(shè)。

在基于培養(yǎng)方法的傳統(tǒng)微生物檢測過程中，沒有發(fā)現(xiàn)這2例患者送檢的臨床樣本中的大量專性厭氧菌，只檢出樣本中兼性厭氧的星座鏈球菌和大腸埃希菌，推測可能是在樣本采集及運(yùn)輸過程中沒有使用專用的厭氧容器，同時送檢過程較長，導(dǎo)致送檢的臨床樣本中的專性厭氧微生物活力降低甚至死亡，進(jìn)而影響了后續(xù)厭氧菌培養(yǎng)的結(jié)果[7]。NGS在患者體內(nèi)病原菌被清除后，仍能檢出其殘留的核酸[8]。NGS篩查病原菌不依賴分離培養(yǎng)，可直接對臨床樣本進(jìn)行測序分析，相較于常規(guī)細(xì)菌鑒定過于依賴檢驗人員的經(jīng)驗來挑選待檢菌落，NGS能夠?qū)颖具M(jìn)行無偏差的測序，從而得到臨床樣本中各種已知或未知病原體的相關(guān)信息。

NGS也有其局限性，如臨床樣本類型復(fù)雜，數(shù)據(jù)庫的覆蓋范圍不夠，導(dǎo)致NGS不能采取通用的樣本處理和軟件分析方法。同時，人員操作失誤、儀器運(yùn)行故障以及最終測序結(jié)果解讀不當(dāng)都可能導(dǎo)致診療決策失誤。但隨著測序成本的不斷降低，可以對患者不同部位、不同時期的樣本進(jìn)行測序，從而有效規(guī)避由于儀器和人員失誤造成的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。