脂聯(lián)素通過AMPK/mTOR/4EBP1通路對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響

隆曜先，王毛毛，蔡志福，張潔清，李 力

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，廣西 南寧 530021

脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)，由脂肪細(xì)胞分泌，并大量存在于血液循環(huán)中［1-2］。有研究發(fā)現(xiàn)，APN對胰島素有增敏作用［3-4］，并與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展呈負(fù)相關(guān)［5-6］。然而，APN影響子宮內(nèi)膜癌的機制尚未明確。本研究通過探討APN對HEC-1B細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/磷酸化真核啟動因子4E結(jié)合蛋白1（4E binding protein 1，4EBP1）信號通路的影響，檢測B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）與基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）mRNA及蛋白的表達(dá)，以及APN對HEC-1B細(xì)胞侵襲能力的影響，為子宮內(nèi)膜癌的診治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞株

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B（雌激素受體弱陽性）購自北京大學(xué)。重組人APN購自捷克Biovendor公司；反轉(zhuǎn)錄檢測試劑盒購自美國Fermentas公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）技術(shù)檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；復(fù)合物C（AMPK抑制劑）購自德國Calbiochem公司；兔抗人AMPK和磷酸化AMPK（phosphorylate-AMPK，p-AMPK）單克隆抗體、兔抗人mTOR和磷酸化mTOR（phosphorylate-mTOR，p-mTOR）多克隆抗體、兔抗人4EBP1和磷酸化4EBP1（phosphorylate-4EBP1，p-4EBP1）單克隆抗體、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將HEC-1B細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中并置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培育及傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］及本實驗前期研究［9］發(fā)現(xiàn)，20 μg/mL APN作用30 min是最佳濃度與時間，因此后續(xù)實驗皆以該數(shù)據(jù)進(jìn)行實驗。實驗分為4組：

①對照組：僅加入無血清DMEM培養(yǎng)基；② APN組：20 μg/mL APN作用于細(xì)胞30 min；③抑制劑組：10 μmol/L復(fù)合物C作用于細(xì)胞30 min；④ APN+抑制劑組：10 μmol/L復(fù)合物C預(yù)處理細(xì)胞30 min后，加入20 μg/mL APN作用30 min。

1.3 RTFQ-PCR檢測細(xì)胞Bcl-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)

用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RTFQ-PCR檢測。根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物序列。Bcl-2上游引物為：5’-TTGGATCAGGGAGTTGGAAG-3’，下游引物為：5’-TGTCCCTACCAACCAGAA GG-3’，擴(kuò)增長度片段為295 bp；MMP-9上游引物為：5’-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3’，下游引物為：5’-CCACCTGGTTCAACTCACTC C-3’，擴(kuò)增長度片段為94 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物為：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAG TC-3’，下游引物為：5’-GAAGATGGTGATG GGATTTC-3’，擴(kuò)增長度片段為246 bp。PCR反應(yīng)體系：DNA熒光染料SYB-R Green 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，ddH2O 6.4 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)40次。實驗重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

用含有苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液于冰上裂解收集各組細(xì)胞蛋白，并用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離100 μg蛋白，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉PVDF膜1 h，分別加入一抗AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、Bcl-2、MMP-9（濃度均為1∶1000），4 ℃搖床溫育過夜。第2天取出PVDF膜置于含有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗的離心管中，室溫溫育1.5 h。含0.05%吐溫20的洗膜緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光掃膜并分析數(shù)據(jù)。使用Image-Lab軟件分析灰度值數(shù)據(jù)，以GAPDH作為內(nèi)參照，AMPK蛋白活化水平以p-AMPK/AMPK比值表示，mTOR活化水平以pmTOR/mTOR比值表示，4EBP1活化水平以p-4EBP1/4EBP1比值表示。實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞體外穿膜實驗檢測細(xì)胞遷移能力

無血清培養(yǎng)基重懸各組細(xì)胞使細(xì)胞密度為105/mL，100 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室每孔中；下室每孔加入600 μL 20%胎牛血清培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小室放入4%多聚甲醛中，使小室濾膜底面充分浸泡在其中，固定30 min。吉姆薩染色后在200倍顯微鏡下觀察，隨機取5個視野拍照。計算5個視野遷移細(xì)胞數(shù)的平均值。實驗重復(fù)3次。

1.6 劃痕實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時，吸掉培養(yǎng)基并用PBS沖洗細(xì)胞3次，用10 μL移液器吸嘴沿著培養(yǎng)板中央劃一橫線，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，于恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)過夜，分別在0、24 h時于倒置顯微下觀察細(xì)胞運動情況并拍照記錄。計算劃痕面積并計算遷移率，公式：細(xì)胞遷移率（%）＝［（劃痕時面積-24 h后面積）/劃痕時面積］×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所有實驗數(shù)據(jù)均以表示，多組資料比較用單因素方差分析，多組資料的組間比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）分析。兩組資料比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APN及AMPK抑制劑作用后各組細(xì)胞中Bcl-2、MMP-9 mRNA表達(dá)及蛋白水平

RTFQ-PCR檢測結(jié)果顯示，APN組中，HEC-1B細(xì)胞Bcl-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)分別為0.64±0.08和0.68±0.02，與對照組（1.00±0.00）相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002，P=0.001）；APN+抑制劑組Bcl-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)分別為0.98±0.11和0.96±0.08，與APN組相比較，均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02，P=0.03，圖1A）。

APN組中，HEC-1B細(xì)胞Bcl-2和MMP-9蛋白水平分別與對照組、抑制劑組、APN+抑制劑組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00，圖1B）。

圖1 APN及AMPK抑制劑作用后HEC-1B細(xì)胞中Bcl-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression levels of Bcl-2 and MMP-9 mRNA and proteins in HEC-1B cells after treatment with APN and AMPK inhibitors

2.2 APN及AMPK抑制劑作用于細(xì)胞后AMPK、mTOR和4EBP1的活化情況

Western blot檢測結(jié)果顯示，20 μg/mL APN作用HEC-1B細(xì)胞30 min后可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞AMPK磷酸化，但抑制mTOR、4EBP1蛋白活化水平（P=0.00），復(fù)合物C可明顯抑制APN的這種誘導(dǎo)和抑制作用（P=0.05，表1，圖2）。

2.3 APN對細(xì)胞遷移能力的影響

體外穿膜實驗結(jié)果顯示，APN組穿膜細(xì)胞數(shù)為（78.72±10.74）個，APN+抑制劑組為（131.45±9.11）個，對照組為（131.91±12.29）個，抑制劑組為（131.56±3.47）個，APN組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00），APN+抑制劑組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.12，圖3）。

2.4 APN對細(xì)胞侵襲能力的影響

細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，24 h后APN組劃痕寬度變化不大，其遷移率為（19.27±1.14）%，較其余3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00）。對照組（66.51±0.60）%、抑制劑組（70.05±0.10）%、APN+抑制劑組（69.18±0.92）%的劃痕寬度在24 h后明顯縮窄，3組組間遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.787，P=0.39，圖4）。

表1 APN及其抑制劑作用后HEC-1B細(xì)胞中AMPK、mTOR和4EBP1蛋白活化水平的比較Tab.1 Comparison of activation levels of AMPK,mTOR and 4EBP1 proteins of HEC-1B cells after treatment with APN and its inhibitors()

表1 APN及其抑制劑作用后HEC-1B細(xì)胞中AMPK、mTOR和4EBP1蛋白活化水平的比較Tab.1 Comparison of activation levels of AMPK,mTOR and 4EBP1 proteins of HEC-1B cells after treatment with APN and its inhibitors()

*:P＜0.05,compared with another three groups

圖2 APN及AMPK抑制劑作用后AMPK、mTOR和4EBP1 Western blot電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of Western blot of AMPK,mTOR and 4EBP1 after treatment with APN and AMPK inhibitors

圖3 體外穿膜實驗檢測4組HEC-1B細(xì)胞的遷移能力Fig.3 HEC-1B cell migration in four groups detected by transwell cell assay

圖4 細(xì)胞劃痕實驗檢測HEC-1B細(xì)胞的侵襲能力Fig.4 Cell scratch test to detect the invasive ability of HEC-1B cells

3 討論

APN是一種在脂肪組織中特異性表達(dá)的激素，其主要是通過與細(xì)胞表面的APN受體結(jié)合在體內(nèi)發(fā)揮作用［10］。近年來，APN被認(rèn)為是一種強有力的抑制腫瘤細(xì)胞生長的抗癌因子［11］。有研究顯示，APN與多種惡性腫瘤關(guān)系密切，與其發(fā)病率呈反比，包括結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌。子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其患病率在中國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中已躍居第二位，僅次于宮頸癌。對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病因素及其治療的研究一直是國內(nèi)外研究的熱點。Yamauchi等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在高級別子宮內(nèi)膜癌組織中，APN受體相應(yīng)的減少，表明APN與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。也有學(xué)者［12-13］提出，APN、瘦素等細(xì)胞因子可能通過AMPK/mTOR信號通路抑制組織蛋白合成和細(xì)胞生長。因此，認(rèn)為APN可能對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用。

本研究以20 μg/mL APN作用子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞30 min后，AMPK蛋白磷酸化水平明顯增強，mTOR、4EBP1蛋白磷酸化水平明顯降低，而僅以10 μmol/L復(fù)合物C作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞30 min或復(fù)合物C預(yù)處理細(xì)胞30 min后，再加入20 μg/mL APN作用30 min后，AMPK、mTOR和4EBP1蛋白的表達(dá)水平則均無明顯變化，提示一定濃度APN作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞一定時間后，可激活A(yù)MPK信號通路，激活的AMPK可抑制其下游蛋白mTOR、4EBP1的活化。

本研究發(fā)現(xiàn)，APN能抑制HEC-1B細(xì)胞的遷移、侵襲，而復(fù)合物C可阻斷APN的這種抑制作用；在APN處理組中細(xì)胞的穿膜數(shù)與遷移率明顯低于對照組，而復(fù)合物C預(yù)處理與處理組中細(xì)胞的穿膜數(shù)與遷移率較對照組則無明顯差別。因此，上述結(jié)果提示APN在一定濃度、時間下可激活A(yù)MPK通路，并抑制HEC-1B細(xì)胞遷移、侵襲；表明激活A(yù)MPK通路是APN抑制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一，這為延遲或終止子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展提供了新方向。

惡性腫瘤的一大重要特征是生長不受限制，這不僅是由腫瘤細(xì)胞增殖和分化失控導(dǎo)致的，也與細(xì)胞的凋亡及腫瘤細(xì)胞的侵襲性有關(guān)。Bcl-2是一種較穩(wěn)定的蛋白，可使多種因素導(dǎo)致的凋亡受到延遲或阻止；MMP-9可以促進(jìn)分泌明膠酶B，破壞細(xì)胞基底膜的完整性，進(jìn)而發(fā)揮促惡性腫瘤細(xì)胞生長與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，APN可抑制HEC-1B細(xì)胞Bcl-2、MMP-9 mRNA與蛋白的表達(dá)，而復(fù)合物C亦可阻斷APN這種作用，提示APN可通過激活A(yù)MPK，下調(diào)Bcl-2、MMP-9的表達(dá)，從而抑制HEC-1B細(xì)胞的侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，APN可通過激活A(yù)MPK來下調(diào)Bcl-2、MMP-9的表達(dá)；并可通過刺激AMPK磷酸化，抑制mTOR、4EBP1磷酸化，降低AMPK/mTOR/4EBP1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各通道蛋白的活性，提示在一定時間和濃度作用下，APN可經(jīng)AMPK/mTOR/4EBP1信號通路發(fā)揮作用，這為人們認(rèn)識脂聯(lián)素抗子宮內(nèi)膜癌的機制提供了新的信息。