JMJD3和Ki-67定量檢測(cè)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌分子分型及臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

徐小艷，王建君，王 慧，王 娜，劉 薇，楊金花

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院（鄭州人民醫(yī)院）病理科，河南 鄭州 450000；

2.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院（鄭州人民醫(yī)院）院士工作站，河南 鄭州 450000；

3.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院（鄭州人民醫(yī)院）乳腺外科，河南 鄭州 450000

乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌又稱非特殊類型浸潤(rùn)性癌，是浸潤(rùn)性乳腺癌中最常見的類型，對(duì)乳腺癌分子標(biāo)志物的研究有助于乳腺癌患者的診斷及預(yù)后判斷。JMJD3又稱賴氨酸去甲基化酶6B，其編碼基因位于人類第17號(hào)染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3作為一種H3K27me3去甲基化酶［1］，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。JMJD3被認(rèn)為是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤評(píng)估指標(biāo)之一［2-3］。但是，JMJD3在乳腺癌中的表達(dá)及生物作用尚不完全清楚，且有關(guān)JMJD3在乳腺癌組織中的表達(dá)規(guī)律與分子亞型及臨床病理學(xué)特征關(guān)系未見報(bào)道。Ki-67增殖指數(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞增殖活性較為理想的指標(biāo)，對(duì)乳腺癌的預(yù)后和治療有重要的臨床意義。為了解在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中JMJD3的表達(dá)情況，以及其與Ki-67是否有相關(guān)性，因此本研究分析JMJD3和Ki-67與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及二者的相關(guān)性，旨在觀察JMJD3和Ki-67在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以拓展和豐富人們對(duì)乳腺癌分子標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)。

1 資料和方法

1.1 病例資料

收集河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院2013年1月—2017年12月的病理活檢標(biāo)本，包括57例正常乳腺組織、38例乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、52例乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌原發(fā)灶。150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者術(shù)前均未接受放療或化療，并收集患者相關(guān)臨床資料。按照2012年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）乳腺癌組織病理學(xué)分級(jí)分類法，對(duì)其進(jìn)行分組。根據(jù)第12屆St.Gallen專家共識(shí)的乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)，在150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中，Luminal A型53例，Luminal B型56例，人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過表達(dá)型15例，三陰性型26例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院病理科確診。

1.2 主要試劑

JMJD3兔抗人多克隆抗體公司購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Ki-67兔抗人單克隆抗體、二抗及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

①石蠟切片（3 μm）經(jīng)烤片、脫蠟并水化；② 抗原修復(fù)；③一抗37 ℃溫育2 h；④ 二抗室溫溫育30 min；⑤ DAB顯色5 min，用于定性觀察和拍照的切片對(duì)比染色，用于定量測(cè)試的切片不對(duì)比染色，脫水、透明、中性樹膠封片。用已知JMJD3和Ki-67陽(yáng)性的乳腺癌組織和PBS代替一抗分別作為陽(yáng)性和空白對(duì)照。

1.4 JMJD3和Ki-67免疫組織化學(xué)定量測(cè)試

根據(jù)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和乳腺癌組織自身陰性對(duì)照的顯色情況，在確定無(wú)假陽(yáng)性和假陰性的前提下，以JMJD3和Ki-67細(xì)胞核染成棕黃色為陽(yáng)性。用Image-Pro Plus（IPP）圖像分析軟件，測(cè)試各例樣本的陽(yáng)性單位（positive unit，PU）值［4］。具體方法如下：用IPP圖像分析軟件在40倍物鏡下，從每例切片中取10個(gè)著色最強(qiáng)的視野輸入計(jì)算機(jī)，將其轉(zhuǎn)換成灰色照片。對(duì)于正常乳腺組織，每個(gè)視野測(cè)試20個(gè)正常乳腺上皮細(xì)胞（數(shù)目不足者，測(cè)完整張切片為止）；對(duì)于乳腺導(dǎo)管癌組織，每個(gè)視野測(cè)試20個(gè)陽(yáng)性癌細(xì)胞。用交互式測(cè)試法測(cè)試每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的灰度Gα，同時(shí)在相應(yīng)的10個(gè)視野中測(cè)試背景灰度Gβ并取其平均值，每例樣本共測(cè)試200個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。本研究中測(cè)試軟件設(shè)定的Gmax為256，按下列公式計(jì)算每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的PU值：

用于定量測(cè)試的切片不復(fù)染，用于定性拍照的切片復(fù)染。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用方差分析對(duì)多樣本均數(shù)之間進(jìn)行比較。若方差不齊，組間多重比較采用Dunnett’ST3檢驗(yàn)；若方差齊，組間多重比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）。兩樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。雙變量相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JMJD3和Ki-67在正常乳腺組織、乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌及乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的定量檢測(cè)

JMJD3蛋白陽(yáng)性表達(dá)部位定位于細(xì)胞核，在乳腺間質(zhì)的纖維細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。其在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中低表達(dá)，在正常乳腺上皮組織中高表達(dá)，在乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)依次降低（圖1，表1）。150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，JMJD3的表達(dá)率為60.00%（90/150），低于正常乳腺組織的91.22%（52/57）。

Ki-67免疫染色陽(yáng)性部位定位于細(xì)胞核，在正常乳腺上皮組織中和乳腺間質(zhì)的纖維細(xì)胞中幾乎未檢出，在乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌組織中較低，在乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中依次升高（圖1，表1）。150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，Ki-67≤14%者24%（36/150），＞14%者76%（114/150）。

2.2 JMJD3和Ki-67與乳腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表1 JMJD3和Ki-67在正常乳腺組織、乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌及乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的PU值Tab.1 PU values of JMJD3 and Ki-67 in normal breast tissue,low-grade ductal carcinoma in situ,high-grade ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma of breast()

JMJD3蛋白與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、pTNM分期均有關(guān)（P＜0.05），即組織學(xué)級(jí)別越低，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移及pTNM分期越早，JMJD3蛋白表達(dá)越高。Ki-67與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、pTNM分期均有關(guān)（P＜0.05），即組織學(xué)級(jí)別越高，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及pTNM分期越晚，Ki-67越高。JMJD3和Ki-67與患者的年齡、腫瘤部位和腫瘤大小均無(wú)關(guān)（P＞0.05，表2）。

2.3 JMJD3和Ki-67的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及診斷閾值

根據(jù)正常乳腺組織、乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌及乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中免疫組織化學(xué)JMJD3和Ki-67的定量檢測(cè)結(jié)果，對(duì)JMJD3和Ki-67在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的特異度和靈敏度做ROC曲線（圖2）。JMJD3的ROC曲線的曲線下面積為0.290，95% CI為0.232～0.348，JMJD3用于區(qū)別乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌與非浸潤(rùn)性癌時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），JMJD3陽(yáng)性值越小，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌可能性越大，當(dāng)JMJD3診斷閾值≤10.87時(shí)，此時(shí)診斷乳腺癌的靈敏度和特異度均較高；Ki-67的ROC曲線的曲線下面積為0.865，95% CI為0.824～0.905，用于區(qū)別乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌與非浸潤(rùn)性癌時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），Ki-67陽(yáng)性率越高，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌可能性越大，當(dāng)Ki-67診斷閾值≥8.08時(shí)，此時(shí)診斷乳腺癌的靈敏度和特異度均較高。

表2 JMJD3和Ki-67與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between levels of JMJD3 and Ki-67 with clinicopathological characteristics of invasive ductal carcinoma of breast()

表2 JMJD3和Ki-67與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between levels of JMJD3 and Ki-67 with clinicopathological characteristics of invasive ductal carcinoma of breast()

圖2 免疫組織化學(xué)法結(jié)合圖像分析檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中JMJD3和Ki-67的ROC曲線Fig.2 ROC curve for levels of JMJD3 and Ki-67 in invasive ductal carcinoma of breast detected by immunohistochemical and image analyses

2.4 JMJD3和Ki-67與乳腺癌分子亞型的關(guān)系

150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，JMJD3蛋白的表達(dá)與分子分型有關(guān)（P=0.000），其在Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達(dá)型、三陰性型中的PU值依次為16.23±5.21、14.20±4.62、9.10±5.00、10.92±4.98。JMJD3蛋白的表達(dá)在Luminal A型和Luminal B型中均高于HER2過表達(dá)型和三陰性型，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Luminal A型JMJD3蛋白表達(dá)高于Luminal B型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；JMJD3蛋白在HER2過表達(dá)型和三陰性型中表達(dá)相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，Ki-67增殖指數(shù)與分子分型有關(guān)（P=0.000），其在Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達(dá)型、三陰性型中的PU值依次為12.40±4.88、14.29±4.97、16.27±6.32、17.44±7.46。Ki-67增殖指數(shù)在Luminal A型和Luminal B型中均低于HER2過表達(dá)型和三陰性型，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Luminal A型Ki-67增殖指數(shù)低于Luminal B型，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ki-67蛋白在HER2過表達(dá)型和三陰性型中表達(dá)相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

2.5 JMJD3和Ki-67的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，JMJD3蛋白水平和Ki-67增殖指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（rP=-0.540，P=0.000），即JMJD3蛋白水平越高，Ki-67越低。

表3 JMJD3和Ki-67與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌分子分型的關(guān)系Tab.3 Relationship between levels of JMJD3 and Ki-67 and molecular subtypes in invasive ductal carcinoma of breast()

表3 JMJD3和Ki-67與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌分子分型的關(guān)系Tab.3 Relationship between levels of JMJD3 and Ki-67 and molecular subtypes in invasive ductal carcinoma of breast()

3 討論

JMJD3作為一種組蛋白去甲基化酶，以往對(duì)該分子的研究主要集中在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域。JMJD3在腫瘤中的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)彭晨等［5］研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3在胃癌中低表達(dá)，且對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用而對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。國(guó)外Tokunaga等［6］對(duì)151例結(jié)腸癌患者生存分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中JMJD3表達(dá)越低，術(shù)后生存期越短，且JMJD3的低表達(dá)是結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組蛋白去甲基化酶JMJD3表達(dá)高于癌旁組織，增加或抑制JMJD3表達(dá)可增強(qiáng)或減弱膠質(zhì)瘤遷移能力［7］。李彥偉等［8］研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞組JMJD3較瘤旁組織表達(dá)降低。胡賀芳等［9］研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3表達(dá)降低可能促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展?；谏鲜鰢?guó)內(nèi)外研究，有關(guān)JMJD3在腫瘤中是促癌基因還是抑癌基因研究報(bào)道尚不一致，推測(cè)JMJD3可能在不同的腫瘤組織中發(fā)揮不同的作用。有關(guān)JMJD3在乳腺癌中的研究，最新國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，過表達(dá)JMJD3參與抑制乳腺癌細(xì)胞干性，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［10］；國(guó)內(nèi)尚未見JMJD3在乳腺癌組織中的表達(dá)規(guī)律及與臨床病理學(xué)特征關(guān)系的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，JMJD3在正常乳腺組織、乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)依次降低，150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中組織學(xué)級(jí)別越低，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移及pTNM分期越早，JMJD3蛋白表達(dá)越高。這表明JMJD3可能參與了乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的演變過程，是腫瘤發(fā)生早期階段的分子事件，JMJD3的缺失促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。乳腺癌分子分型與預(yù)后及治療密切相關(guān)，本研究結(jié)果顯示，JMJD3與乳腺癌分子亞型有關(guān)，即其表達(dá)水平在Luminal A型和Luminal B型中顯著高于HER2過表達(dá)型和三陰性乳腺癌。這表明乳腺癌組織JMJD3免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)個(gè)性化分子靶向治療有幫助。

Ki-67增殖指數(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞增殖活性較為理想的指標(biāo)，對(duì)乳腺癌的預(yù)后和治療有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67在正常乳腺組織、乳腺低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺高級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中陽(yáng)性率依次升高，150例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中組織學(xué)級(jí)別越高，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及pTNM分期越晚，Ki-67陽(yáng)性率越高。Ki-67增殖指數(shù)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌分子亞型有關(guān)，其表達(dá)水平在預(yù)后較好的Luminal A型和Luminal B中較低，在預(yù)后較差的HER2過表達(dá)型和三陰性乳腺癌中較高。本研究中Ki-67與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系與以往國(guó)內(nèi)外研究類似［11-14］。以往文獻(xiàn)對(duì)Ki-67大部分采用定性判讀，本研究采用定量的方法對(duì)JMJD3和Ki-67免疫組織化學(xué)進(jìn)行了定量判讀，與傳統(tǒng)定性方法判讀相比較，定量判讀有如下優(yōu)勢(shì)：①能夠比較直觀地反映蛋白表達(dá)的強(qiáng)度；② 不受圖片本底因素的影響；③不受不同計(jì)算機(jī)圖像分析軟件中灰度的設(shè)定方法及不同灰度分級(jí)因素的影響；④ 受人為因素影響較小。但是與傳統(tǒng)定性比較判讀的缺點(diǎn)是PU值測(cè)試耗時(shí)。

有關(guān)JMJD3和Ki-67在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的相關(guān)性尚未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果表明，JMJD3蛋白水平與Ki-67增殖指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，即JMJD3蛋白表達(dá)水平越高，Ki-67增殖指數(shù)越低?；诒狙芯拷Y(jié)果，我們推測(cè)JMJD3的高表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。有文獻(xiàn)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)JMJD3能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖能力［5］。馮歡等［15］研究表明，基因敲除JMJD3小鼠肺泡上皮的Ki-67陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，說明JMJD3對(duì)肺泡上皮的增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用。上述文獻(xiàn)研究表明，JMJD3能夠負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，本研究不足之處在于僅從蛋白水平分析了JMJD3和Ki-67的相關(guān)性，尚未涉及分子水平層面的研究，有關(guān)JMJD3和Ki-67在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，JMJD3和Ki-67與在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。JMJD3與Ki-67呈負(fù)相關(guān)，提示JMJD3的高表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，其具體分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。