水通道蛋白磁共振分子成像對腦缺血半暗帶的評價(jià)

彭曉瀾，余波，陳秋雁，陳婷婷，吳富淋，魏鼎泰

福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德市醫(yī)院放射科，福建寧德 352100； *通訊作者 魏鼎泰 wdtai83@163.com

急性缺血性卒中是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病[1]。目前治療的關(guān)鍵是急性期，即拯救缺血半暗帶。對缺血半暗帶的影像成像評估是臨床工作者的關(guān)注點(diǎn)[2]。灌注加權(quán)成像（perfusion weighted imaging，PWI）/DWI 不匹配是目前臨床上評估缺血半暗帶比較通用的方法。多b 值DWI-MR 水通道蛋白（aquaporins，AQPs）分子成像（AQP-MRI）是應(yīng)用一種全新的分子水平評估腦缺血的成像技術(shù)。1993 年，Agre 等[3]發(fā)現(xiàn)AQP 而改變了傳統(tǒng)的水分子在細(xì)胞膜上自由擴(kuò)散的理論。AQPs 的表達(dá)水平和分布情況與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是疾病過程中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)[4]；并且內(nèi)生AQP 表達(dá)在幾種疾病中顯示與水?dāng)U散系數(shù)和DWI 有關(guān)[5-6]。

Mukherjee 等[7]報(bào)道將AQP1 作為MRI 報(bào)告基因具有以下優(yōu)點(diǎn)：序列設(shè)計(jì)簡單、對T1 及T2 弛豫率均無影響、無需對比劑、有極高的敏感性、完全內(nèi)源性。此外，酰胺質(zhì)子轉(zhuǎn)移也可以在分子水平評估腦組織代謝情況，但是目前參數(shù)設(shè)置尚不成熟[8]。目前已有研究應(yīng)用AQP-MRI 對離體組織[9]及肝臟纖維化動(dòng)物模型進(jìn)行評估[10]，但AQP-MRI 對缺血半暗帶的評價(jià)鮮有報(bào)道。本研究擬采用AQP-MRI 評價(jià)缺血半暗帶，并與傳統(tǒng)不匹配法進(jìn)行比較，驗(yàn)證AQP-MRI 的診斷效能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只健康成年雄性SD 大鼠由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體重230～260 g，術(shù)前允許大鼠自由攝食，不限制飲水。將30 只大鼠按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法分為缺血組25 只（1、3、6、24、48 h 各5 只）和對照組5 只。本實(shí)驗(yàn)通過倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 大鼠短暫性腦缺血模型的建立 采用線栓法制備大鼠腦缺血-再灌注模型，用4%異氟烷吸入麻醉大鼠，麻醉成功后，用1.5%～2.5%異氟烷維持麻醉，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端分別結(jié)扎動(dòng)脈，距離約1 cm，在兩處結(jié)扎中央剪斷頸外動(dòng)脈，選擇直徑約0.26 mm 的線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈約2 cm，60 min 后退出線栓恢復(fù)再灌注。整個(gè)手術(shù)過程監(jiān)測直腸體溫，維持在36.2～37.2℃。應(yīng)用激光多普勒血流儀監(jiān)測大鼠腦血流灌注量，下降75%以上為建模有效（圖1）。

假手術(shù)組：僅分離出右側(cè)頸部血管、剪斷頸外動(dòng)脈，不做任何夾閉，暴露與上述手術(shù)所需相同時(shí)間后縫合切口。

圖1 激光多普勒血流儀監(jiān)測大鼠腦血流灌注情況

1.3 MRI 檢查 采用GE Discovery 750 3.0T MR 掃描儀，從退出線栓開始分別于1、3、6、24、48 h 行MR 掃描，使用4 通道小動(dòng)物頭部線圈，異氟烷麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定于掃描支架上，頭置于線圈中央，整個(gè)掃描過程中保持1.5%～2.5%異氟烷持續(xù)吸入麻醉。掃描序列包括：①多b 值DWI，共18 個(gè)b 值，分別為30、50、80、100、150、200、300、500、800、1000、1300、1700、2000、2500、3000、3500、4000、4500 s/mm2，掃描參數(shù)：視野（FOV）10.0 cm ×0.50 cm，層厚2.0 mm，TR 3300.0 ms，TE 選最小單位，矩陣128×128，帶寬166.7 kHz，掃描時(shí)間6 min 43 s。②三維動(dòng)脈自旋標(biāo)記（three-dimensional arterial spin labeling，3D-ASL）序列，掃描參數(shù)：FOV 6.0 cm× 6.0 cm，層厚2.0 mm，TR 4877 ms，TE 12.9 ms，矩陣512×512，激勵(lì)次數(shù)3.00，帶寬62.50 kHz，標(biāo)記延遲時(shí)間選取1025 ms，掃描時(shí)間4 min 43 s。③T2 加權(quán)液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)成像（T2-FLAIR），采用FSE 序列，掃描參數(shù)：FOV 10.0 cm×10.0 cm，層厚2.0 mm，TR 8450 ms，TE 145 ms，矩陣256×256，激勵(lì)次數(shù)1.00，帶寬62.50 kHz，翻轉(zhuǎn)角111°，掃描時(shí)間2 min 50 s。④常規(guī)DWI，掃描參數(shù)：FOV 6.0 cm×0.70 cm，層厚2.0 mm，TR 3300 ms，TE 選最小單位，b=0、1000 s/mm2，矩陣128×128，帶寬125.0 kHz，掃描時(shí)間2 min 45 s。

1.4 MR 數(shù)據(jù)分析 掃描完成后，將原始圖像傳送至圖像存檔與傳輸系統(tǒng)及GE Aw Volume Share 5 后處理工作站，應(yīng)用Functool 軟件進(jìn)行后處理，獲得動(dòng)脈自旋標(biāo)記腦血流量（arterial spin labeling-cerebral blood flow，ASL-CBF）和水通道蛋白表觀擴(kuò)散系數(shù)（ aquaporin-apparent dispersion coefficient ， AQPADC）偽彩圖，測量各個(gè)序列每一層面病灶的相對面積，用病灶面積/同層面總面積百分比（%）表示，并且取連續(xù)5 個(gè)層面，最后將所測得總面積除以5，用ra-T2-FLAIR、ra-DWI、ra-AQP、ra-ASL 表示。應(yīng)用Functool 軟件將AQP-MRI 與T2-FLAIR 作圖像融合，以年輪法由內(nèi)向外測量AQP-ADC 值。將每一層面沿縱向中軸線作鏡像分析，在病灶內(nèi)選取感興趣區(qū)，將梗死灶內(nèi)感興趣區(qū)的AQP-ADC 值與鏡像對稱區(qū)域正常腦實(shí)質(zhì)的AQP-ADC 值的比值用rIC 表示，半暗帶區(qū)相對比值用rIP 表示，T2-FLAIR 及DWI 上高信號區(qū)相對比值分別用rT2-FLAIR、rADC 表示。以上每個(gè)層面測量3 次，取平均值。

1.5 病理組織學(xué) 采用光學(xué)顯微鏡及透射電鏡分析大鼠腦組織切片，采用石蠟包埋，切片厚度6 μm，常規(guī)HE 染色，采用奧林巴斯IX71 光學(xué)顯微鏡觀察并顯微攝像。常規(guī)透射電鏡標(biāo)本制備，鉛鈾雙染色，采用FEI TECNAI 透射電鏡下觀察并攝像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0 軟件，計(jì)量資料以±s表示。AQP-MRI/T2-FLAIR 相對面積差（%）分別與DWI/T2-FLAIR 相對面積差（%）、ASL/DWI 相對面積差（%）間比較，以及rIP 分別與rIC、rADC、正常腦組織相對比值（relative normal cerebrum，rNC）間比較均采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各時(shí)間點(diǎn)病灶相對面積ra-T2-FLAIR、ra-DWI、ra-AQP、ra-ASL 動(dòng)態(tài)變化規(guī)律 在對照組，觀察的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，T2-FLAIR、DWI、AQP-MRI、ASL 各序列均未見異常信號（圖2）。缺血組24 h 內(nèi)，ra-T2-FLAIR、ra-DWI、ra-AQP 持續(xù)升高，24 h 后ra-DWI、ra-AQP減少，而ra-T2-FLAIR 繼續(xù)增加（表1，圖3）。

表1 缺血組大鼠缺血不同時(shí)間點(diǎn)病灶的相對面積（%）

圖2 對照組大鼠6 h DWI、ASL、AQP-MRI 序列結(jié)果，DWI、ASL、AQP-MRI 序列在各時(shí)間點(diǎn)均未見異常信號

圖3 缺血組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦缺血病灶面積相對比值（%）動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

在1、3、6、24 h 時(shí)間點(diǎn)，ra-AQP 與ra-T2-FLAIR面積差和ra-DWI 與ra-T2-FLAIR 面積差比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=63.507，P<0.001），并且6 h 后，兩者面積差均迅速減小，至24 h 無明顯差異（表2）。在1、3、6 h 時(shí)間點(diǎn)，ra-AQP 與ra-T2-FLAIR 面積差和ra-ASL 與ra-DWI 面積差比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.295，P=0.001；表3，圖4）。AQP-MRI 與T2-FLAIR 不匹配區(qū)域顯示的半暗帶比DWI/T2-FLAIR不匹配顯示的半暗帶范圍大，AQP-MRI 偽彩圖能多層次顯示病灶內(nèi)的微觀信息（圖5）。

表2 24 h 內(nèi)AQP-MRI 與T2-FLAIR 相對面積差（%）、DWI 與T2-FLAIR 相對面積差（%）比較

表3 6 h 內(nèi)AQP-MRI 與T2-FLAIR 相對面積差（%）、ASL 與DWI 相對面積差（%）

圖4 缺血組大鼠腦缺血3 h 圖像融合顯示不匹配區(qū)缺血半暗帶。左圖為AQPMRI 與T2-FLAIR 融合圖像，黃色區(qū)域代表核心梗死區(qū)，白線區(qū)域代表AQP 半暗帶外邊界；右圖為ASL 與DWI 融合圖像，黃色區(qū)域代表核心梗死區(qū)，白線區(qū)域代表ASL 半暗帶外邊界

圖5 缺血組大鼠缺血1、3、6 h AQP-MRI、DWI、ASL 顯示腦梗死灶。1、3、6 h AQPMRI 顯示腦缺血灶范圍較DWI 大，AQPMRI 偽彩圖可多層次顯示病灶內(nèi)部微觀信息，ASL 顯示缺血區(qū)低灌注

2.2 各時(shí)間點(diǎn)病灶相對比值rT2-FLAIR、rADC、rAQP-ADC 的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律 正常大鼠基底節(jié)區(qū)ADC 值為（5.35±0.84）×10-4mm2/s，rADC 值為（99.3±2.3）%。再灌注后rADC、rIC、rIP 值均持續(xù)下降，到24 h 達(dá)到最低點(diǎn)，之后緩慢回升，呈先降后升趨勢。rT2-FLAIR 值在1～3 h 直線上升，3～48 h 緩慢增加，類似“平臺期”（表4，圖6）。1、3、6、24 h，rIP 與rADC、rIC 比值變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.207，P<0.001；兩兩比較采用LSD 法，rIP 與rADC、rIP 與rIC 的95%CI分別為9.84～18.76 及16.94～25.86）。1、3、6 h，rIP 與rNC 比值變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=151.909，P<0.001）。

表4 缺血組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)病灶相對比值（%）

圖6 缺血組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦缺血病灶相對比值動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

2.3 組織病理學(xué)改變 光學(xué)顯微鏡和透射電鏡下分別觀察正常腦組織、梗死區(qū)及半暗帶區(qū)腦組織的病理改變。半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)明顯不同于正常腦組織與梗死區(qū)，半暗帶區(qū)是缺血的腦組織向壞死轉(zhuǎn)變的過渡（圖7）。

3 討論

本研究成功地應(yīng)用一種全新的MR 分子成像技術(shù)AQP-MRI 對缺血性卒中，特別是急性期缺血半暗帶進(jìn)行評價(jià)，與傳統(tǒng)的不匹配法相比，AQP-MRI 可以更多層次、更加精準(zhǔn)地在體實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯示缺血半暗帶。

圖7 光學(xué)顯微鏡和透射電鏡顯示正常腦組織、梗死區(qū)及半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。A.正常神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元核大，核仁明顯（HE，×400）；B.透射電鏡下觀察正常神經(jīng)元，核膜、胞膜完整，內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、散在線粒體，高爾基復(fù)合體，少數(shù)溶酶體，周圍分布密密麻麻的突起（×12 000）；C.細(xì)胞核碎裂、溶解，細(xì)胞內(nèi)水腫，細(xì)胞與血管周圍間隙增寬（HE，×400）；D.透射電鏡下顯示壞死的細(xì)胞，胞膜破壞、核溶解，胞漿腫脹（×10 000）；E.細(xì)胞核固縮，形態(tài)不清，部分胞漿嗜酸性變，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水腫（HE，×400）；F.透射電鏡下觀察凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈凋亡狀態(tài)，核膜完整，但胞漿腫脹，向壞死轉(zhuǎn)變（×10 000）

3.1 AQP-MRI 對缺血半暗帶的評價(jià) AQP-MRI 是近年新興的MR 分子成像技術(shù)，本研究采用2000 s/mm2以上6 個(gè)高b 值擬合得到的AQP-ADC 值，b 值越高，MR 檢測的對象越接近AQP 內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的水分子微觀信息。缺血半暗帶由Astrup 等[11]于1981 年提出，其最初的定義為腦缺血后壞死灶周圍的腦組織內(nèi)細(xì)胞電活動(dòng)終止，但尚可維持自身的離子平衡。此后，研究者們試圖通過各種影像成像技術(shù)顯示缺血半暗帶。傳統(tǒng)的半暗帶成像包括DWI/T2-FLAIR不匹配和PWI/DWI不匹配。盡管一直以來PWI/DWI 不匹配作為半暗帶的評估標(biāo)識得到廣泛應(yīng)用，但是這種方法尚存在爭議。因?yàn)镈WI 并不總意味著不可逆梗死組織，而PWI 代表的有風(fēng)險(xiǎn)組織中包含良性缺血區(qū)[12-13]，并且僅依據(jù)灌注相關(guān)閾值定義半暗帶外邊界不夠準(zhǔn)確[14]。這就向傳統(tǒng)的半暗帶成像概念提出了挑戰(zhàn)。

本研究半暗帶內(nèi)邊界的界定選擇T2-FLAIR，因?yàn)門2-FLAIR 高信號提示組織已發(fā)生壞死，盡管T2在早期缺血時(shí)基本不變，但總體比DWI 更加可靠和準(zhǔn)確[15]。半暗帶外邊界選擇AQP-MRI，代表腦組織缺血能量代謝障礙，Na+-K+/ATP 酶和其他離子泵衰竭，細(xì)胞內(nèi)外的離子失去平衡而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)水腫[16]，AQP-MRI 可以直觀地反映細(xì)胞毒性水腫的病理生理狀態(tài)。因此，AQP-MRI 可作為半暗帶外邊界的良好觀察目標(biāo)。由于T2WI 和DWI 分別是血管源性水腫和細(xì)胞毒性水腫可靠的檢查方法[17-18]，本研究結(jié)果顯示，24 h 后以血管源性水腫為主，DWI 代表的細(xì)胞毒性水腫消退，ra-AQP 24 h 后變化趨勢與DWI 相同。在24 h 內(nèi)，AQP/T2-FLAIR 不匹配面積與DWI/T2-FLAIR 不匹配面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），并且前者比后者顯示的面積大，AQP-MRI 偽彩圖能多層次顯示病灶內(nèi)的微觀信息，提示AQP-MRI 與DWI比較，由于前者是在雙指數(shù)模型的基礎(chǔ)上成像的，比DWI 單指數(shù)模型能更好地反映生物體內(nèi)復(fù)雜的信號衰減[19]，故選用AQP-MRI 作為半暗帶外邊界比DWI能多層次地顯示半暗帶，而DWI 則是綜合的表現(xiàn)，即AQP-MR 定義的半暗帶比傳統(tǒng)的DWI 作為外邊界意義上的半暗帶更具有診斷準(zhǔn)確性和優(yōu)越性。本研究在6 h 內(nèi)ASL 患側(cè)均呈大面積低灌注區(qū)，AQP/T2-FLAIR 不匹配面積明顯小于ASL/DWI 不匹配面積（P=0.001），這也在一定程度上提示ASL 由于包含良性缺血性區(qū)而高估了半暗帶外邊界，故AQP/T2-FLAIR 不匹配可以較為準(zhǔn)確地顯示缺血半暗帶。

3.2 AQP/T2-FLAIR 不匹配顯示的半暗帶在時(shí)空分布上的特點(diǎn) 本研究結(jié)果顯示在24 h 內(nèi)，相對面積ra-T2-FLAIR、ra-DWI、ra-AQP 持續(xù)升高，24 h 是一個(gè)重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)，24 h 以后ra-DWI、ra-AQP 減少，而ra-T2-FLAIR 繼續(xù)增加，提示24 h 以后以血管源性水腫為主，DWI 和AQP 代表的細(xì)胞毒性水腫消退。AQP/T2-FLAIR 不匹配區(qū)域提示6 h 以內(nèi)存在較大范圍的缺血半暗帶，6 h 以后不論AQP/T2-FLAIR 還是DWI/T2-FLAIR，不匹配面積均迅速減小，提示半暗帶迅速縮小，至24 h 基本無半暗帶。由此得知，大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）后，半暗帶持續(xù)存在約24 h。而ASL 在6 h 內(nèi)患側(cè)呈大面積低灌注，由于這低灌注區(qū)包含良性缺血區(qū)，即血流減少但不進(jìn)展為梗死的區(qū)域，故在某種程度上會(huì)給ASL 閾值測量造成混淆，也因此本研究并未對ASL-CBF 閾值做進(jìn)一步測定。24 h ASL 基本呈高灌注，這與恢復(fù)再灌注后的過度灌注有關(guān)[20]，對于6～24 h 內(nèi)ASL 的變化趨勢無法得知，故在6 h 以后，ASL/DWI 不匹配定義的半暗帶的變化情況就不得而知。由此可知，在大鼠MCAO再灌注模型中，應(yīng)用AQP-MRI 可以對缺血半暗帶的演變進(jìn)行在體全程實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察。

3.3 缺血性卒中AQP-MRI表現(xiàn)與病理相關(guān)性 本研究觀察到MCAO 后，rADC、rIC、rIP 值均持續(xù)下降，到24 h 達(dá)到最低點(diǎn)，以后緩慢回升，呈先降后升趨勢。24 h 內(nèi)，rIP 與rIC 比值變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；6 h 內(nèi)，rIP 與rNC 比值變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。這是否提示在半暗帶區(qū)發(fā)生的病理生理變化和結(jié)構(gòu)功能改變與周圍正常腦組織、T2-FLAIR 顯示的梗死核心區(qū)不同？組織病理學(xué)證實(shí)了這一點(diǎn)。光學(xué)顯微鏡及透射電鏡顯示對照組和半暗帶外圍正常腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)正常。半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞體積增大，形態(tài)腫脹，細(xì)胞核固縮，形態(tài)不清，部分胞漿嗜酸性變，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水腫；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體腫脹，并可見細(xì)胞內(nèi)水腫和凋亡細(xì)胞。壞死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞腫脹破壞，細(xì)胞核碎裂、溶解，細(xì)胞與血管周圍間隙增寬，壞死灶累及皮層；可見廣泛的水腫、髓鞘破壞及細(xì)胞核的溶解，充分說明MR表現(xiàn)與組織學(xué)改變密切相關(guān)。

AQP 分子半暗帶從細(xì)胞水腫理論著手闡述內(nèi)界是已壞死的組織，外界是發(fā)生細(xì)胞毒性水腫的區(qū)域，基于這個(gè)理論，可排除良性缺血性區(qū)，減少PWI 對半暗帶高估帶來的不利影響。AQP-MRI 對細(xì)胞內(nèi)水腫可提供直接、可視化的結(jié)果，序列操作簡單、耗時(shí)少，為臨床研究提供了可靠保障。

本研究的局限性：本研究采用的動(dòng)物模型為短暫性腦缺血模型，尚不能完全模擬人類卒中。盡管采用統(tǒng)一的建模標(biāo)準(zhǔn)，但由于存在個(gè)體差異，結(jié)果存在一定的偏倚。AQP-MRI 與病理生理機(jī)制的探討處于初步階段，需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究通過多模態(tài)MR 掃描，特別是應(yīng)用AQP-MR 分子成像對大鼠短暫性腦缺血模型進(jìn)行48 h的縱向觀察，并對缺血早期半暗帶組織進(jìn)行評估。與傳統(tǒng)的不匹配法相比，AQP-MRI/T2-FLAIR 不匹配可多層次、更精準(zhǔn)地對缺血半暗帶進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，且MR 表現(xiàn)與組織病理學(xué)改變密切相關(guān)。本研究所描述的一系列影像學(xué)動(dòng)態(tài)演變規(guī)律為進(jìn)一步認(rèn)識缺血半暗帶提供了依據(jù)，對于臨床篩選適合治療的患者具有重要意義。