蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷昆明種小鼠的協(xié)同保護作用

韓瑜瑋，劉洋洋，陳 偉

（山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東 泰安 271000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris（L.）Link）又稱北蟲草，是少數(shù)可以規(guī)模化生產(chǎn)的食用真菌之一，也是我國最常見、分布最廣、藥用價值極高的一種蟲草菌[1]。蛹蟲草中的主要活性成分蛹蟲草多糖具有抑制腫瘤、抗炎癥、抗病毒、抑菌、調(diào)節(jié)免疫等功能[2-4]。多數(shù)研究認為蛹蟲草多糖對肝臟的保護作用主要是通過提高機體的抗脂質(zhì)過氧化能力、改善人體細胞免疫和體液免疫及提高巨噬細胞的吞噬功能實現(xiàn)[5-9]。

發(fā)酵型酸奶有提高自由基清除能力、過氧化物清除能力，降低血清膽固醇水平的功效[11-13]。蔡宇[14]、朱蘊蘭[15]等利用蛹蟲草菌絲體及發(fā)酵液研制了一種功能性酸奶飲料。

隨著我國居民飲酒頻率和脂肪攝入量增加，酒精性肝損傷成為除病毒性肝炎之外的另一個重要危險因素[16]。而蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷協(xié)同保護作用的研究鮮有報道。因此，本實驗通過蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵獲得蛹蟲草胞外多糖，以添加蛹蟲草胞外多糖及保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌3 種混菌發(fā)酵的酸奶為研究對象，灌胃酒精模型小鼠。通過生化指標的變化分析蛹蟲草多糖酸奶對小鼠酒精性肝損傷的協(xié)同保護作用，為開發(fā)蛹蟲草多糖功能性乳制品提供數(shù)據(jù)支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雄性昆明小鼠56 只，體質(zhì)量（20f 2）g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2018-0003。

蛹蟲草菌種，由山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院提供；植物乳桿菌發(fā)酵劑 常州益菌加生物科技有限公司；脫脂乳粉 澳大利亞邁高乳業(yè)公司。

聯(lián)苯雙酯滴丸 萬邦德制藥集團股份有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測試盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測試盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測試盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒 南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

PDA固體培養(yǎng)基：土豆20%（質(zhì)量分數(shù)，下同）、瓊脂粉2%、葡萄糖2%、K2HPO40.15%、MgSO40.10%，121 ℃滅菌20 min。

蛹蟲草液體培養(yǎng)基：土豆2 0%、葡萄糖2%、K2HPO40.15%、MgSO40.10%，121 ℃滅菌20 min[17]。

1.2 儀器與設備

SMP500-17805-2BF0酶標儀 上海閃譜生物科技公司； TDZ5-WS臺式多管自動平衡離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；SW-CJ-1CU潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮有限公司； 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；RM2135石蠟切片機 德國Leica公司；HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng) 武漢千屏影像技術(shù)有限公司；YD-A型攤片機、YD-6L型冷凍工作臺、YD-6L型全自動生物組織包埋機 浙江金華益迪醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草多糖提取

蛹蟲草菌種在PDA固體培養(yǎng)基中活化，在無菌條件下接種到滅菌的蛹蟲草液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，抽濾；濾液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積1/5；用體積分數(shù)95%乙醇溶液4 ℃醇析24 h，3 800 r/min離心，獲得粗多糖；溶解至一定體積水中，以1/4體積量加入Sevag液（氯仿-正丁醇體積比4∶1），去蛋白；多糖溶液醇析24 h，3 800 r/min離心，獲得脫蛋白多糖；Sephadex G-100柱過濾層析，得到蛹蟲草多糖純品[18]。

1.3.2 蛹蟲草多糖的分子質(zhì)量測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）測定蛹蟲草的重均分子質(zhì)量（weight-average molecular weights，Mw）、數(shù)均分子質(zhì)量（numberaverage molecular weights，Mn）和平均分子質(zhì)量（z-average molecular weight，Mz）[18]。

1.3.3 蛹蟲草多糖的基本指標測定

使用苯酚-硫酸法測定蛹蟲草多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)，用Bradford的方法測定蛋白質(zhì)量分數(shù)，通過間羥基二苯基比色法測定糖醛酸質(zhì)量分數(shù)[18]。

1.3.4 蛹蟲草多糖酸奶的配制

加入13%（質(zhì)量分數(shù)，下同）脫脂乳粉、6%蔗糖，蛹蟲草多糖質(zhì)量分數(shù)分別為0、0.03%、0.06%、0.12%，95 ℃水浴15 min進行巴氏殺菌，待冷卻至42 ℃，接種0.1%發(fā)酵菌粉（植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌接種質(zhì)量比為3∶1∶1），制備蛹蟲草多糖益生菌酸奶，41 ℃恒溫培養(yǎng)發(fā)酵6 h，后熟12 h，4 ℃貯存?zhèn)溆肹19]。

1.3.5 動物分組及給藥

小鼠隨機分7 組，每組8 只，適應性喂養(yǎng)3 d后，除空白對照組外，各組每天灌胃150 mg/kgmb體積分數(shù)40%乙醇溶液，建立小鼠酒精性肝損傷模型。每日灌胃相應樣品，共給藥28 d，期間供給顆粒飼料，不限制飲食飲水。分組及給藥劑量如表1所示。

表 1 各組小鼠的基本給藥情況（n＝8）Table 1 Administration scheme for mice in each group (n= 8)

1.3.6 檢測方法及檢測指標

1.3.6.1 一般情況觀察

實驗期間觀察小鼠的體質(zhì)量變化、進食、狀態(tài)、毛發(fā)及死亡情況。

1.3.6.2 小鼠肝臟指數(shù)測定

小鼠肝臟指數(shù)根據(jù)下式計算。

1.3.6.3 小鼠血清的制備

小鼠眼球取血置于離心管中，放置30 min，3 800 r/min離心10 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.4 血液中生化指標的測定按照試劑盒說明測定血清ALT、AST、LDL-C和HDL-C，測量血漿TG和TC水平[20]。

1.3.6.5 小鼠肝臟組織勻漿的制備

小鼠脫頸處死，迅速刨出肝臟組織用預冷的生理鹽水洗去殘留血，濾紙拭干，稱質(zhì)量。按1∶9（m/V）比例制成10%組織勻漿液，4 ℃條件貯存?zhèn)溆肹21]。

1.3.6.6 肝臟組織中生化指標的測定

按照試劑盒說明測定SOD、GSH-Px活力及MDA含量。采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.6.7 病理學切片的制作

質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中固定24 h，脫水透明處理，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學變化[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包完成統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，組間差異顯著性比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草多糖的分子質(zhì)量

蛹蟲草多糖Mw、Mn和Mz分別為2.5 8 h 1 03、1.95h 103、3.15h 103Da，Mw/Mn為1.32。

2.2 蛹蟲草多糖的基本指標

蛹蟲草多糖的總糖質(zhì)量分數(shù)、蛋白質(zhì)量分數(shù)、糖醛酸質(zhì)量分數(shù)分別為（8 4.0 2 f 3.7 5）%、（3.18f 0.12）%、（17.65f 0.07）%。

2.3 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

乙醇灌胃小鼠后，小鼠均表現(xiàn)出四肢癱軟等興奮狀態(tài)[22]。不同添加量（0.03%、0.06%、0.12%）蛹蟲草多糖酸奶對小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響見表2，在空白對照組和模型組之間觀察到體質(zhì)量增長比例沒有顯著的變化。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著提高了56.82%（P＜0.05），說明乙醇能夠造成小鼠肝腫脹。與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶組，陽性對照組小鼠肝臟指數(shù)分別降低3.38%、7.89%、13.21%、16.26%、25.93%。與酸奶對照組相比，高劑量蛹蟲草多糖酸奶組肝臟指數(shù)顯著下降13.13%（P＜0.05）。與陽性對照組相比，低、中、高劑量蛹蟲草多糖酸奶組肝臟指數(shù)均有提高，分別提高24.35%、17.17%、13.04%。

表 2 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on body mass and liver index in mice

2.4 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響

在本研究中，模型組與空白對照組相比，模型組ALT、AST活力分別增加了91.84%、65.52%（表3），表明建模成功[23]。ALT和AST均為非特異性細胞內(nèi)功能酶，在正常動物血清中的含量很低[24]，當肝細胞損傷時，肝細胞膜通透性增加，ALT、AST逸出細胞進入血漿使酶活力增高，是臨床上常用的肝功能評價 指標[25]。所以ALT與AST活力可以在一定程度上反映生物體內(nèi)肝細胞的損傷程度[26]。

表 3 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠血清AST、ALT活力的影響Table 3 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on AST and ALT activities in serum of mice

與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶組，陽性對照組ALT活力分別顯著降低10.99%、33.33%、47.87%、58.87%、40.07%，AST活力下降8.74%、22.51%、34.55%、38.89%、 42.19%（P＜0.05）。

未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對肝功能有一定作用，與模型組相比，ALT、AST活力分別顯著性降低10.99%、8.74%。而高劑量蛹蟲草多糖酸奶效果更加明顯，與模型組相比，ALT活力顯著性降低58.87%，AST活力下降38.89%。說明蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高肝功能。與陽性對照組相比，蛹蟲草多糖高劑量酸奶組ALT活力顯著降低31.36%，AST活力提高5.71%，高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯同樣對小鼠肝功能有很好的改善作用。

2.5 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝臟脂肪代謝的影響

表 4 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠血清TG、TC、HDL-C、 LDL-C濃度的影響Table 4 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on TG, TC, HDL-C and LDL-C contents in serum of mice

小鼠經(jīng)酒精連續(xù)灌胃28 d后，肝臟發(fā)生脂肪性病變，脂肪代謝能力下降，導致血液中TG、TC濃度上升[27]。模型組TG、TC濃度均明顯高于空白對照組（P＜0.05），各樣品處理組與模型組相比，TG、TC濃度均降低 （表4）。與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組，陽性對照組TG濃度分別下降4.43%、25.09%、33.21%、39.48%、42.44%，TC濃度分別下降4.86%、12.71%、20.75%、26.92%、31.78%。與陽性對照組相比，蛹蟲草多糖高劑量酸奶處理組TG、TC濃度分別下降5.13%、7.12%。

HDL、LDL與膽固醇在體內(nèi)的運輸密切相關(guān)，HDL-C、LDL-C濃度會隨著血液中TG濃度的變化而改變[28-30]。同對照組相比，模型組HDL-C濃度顯著下降 （P＜0.05），LDL-C濃度顯著上升（P＜0.05）。與模型組相比，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組，陽性對照組的LDL-C濃度分別降低10.24%、24.88%、30.73%、38.54%、80.00%，HDL-C濃度分別提高1.33%、7.33%、14%、20.67%、12.00%。與陽性對照組相比，蛹蟲草多糖高劑量酸奶處理組，HDL-C濃度顯著提高2.07 倍，LDL-C水平顯著提高了7.74%。

未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對脂肪代謝能力的提高有一定作用，與模型組相比，TG、TC、LDL-C濃度顯著降低4.43%、4.86%、10.24%，HDL-C濃度提高1.33%。而高劑量蛹蟲草多糖酸奶與模型組相比，TG、TC、LDL-C濃度分別顯著降低39.48%、26.92%、38.54%，HDL-C含量顯著提高20.67%，蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高脂肪代謝能力。高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯都對小鼠肝臟脂肪代謝有很好的促進作用。

2.6 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力的影響

表 5 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 5 Effect of yoghurt with Cordyceps militaris polysaccharides on SOD and GSH-Px activities and MDA level in liver of mice

MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物[31]用于量化脂質(zhì)過氧化程度，在一定程度上反映組織損傷時出現(xiàn)的過強氧化作用。肝臟組織中MDA含量越高，說明其氧化活性越強，肝臟組織受損越嚴重[32-33]。模型組與空白對照組相比，MDA含量顯著上升26.18%（P＜0.05）（表5）。與模型組相比，酸奶對照組，低、中、高劑量蛹蟲草多糖酸奶組，陽性對照組差異顯著（P＜0.05）。

SOD、GSH-Px是消除活性氧的重要內(nèi)源性抗氧化酶[34]。 小鼠在40%乙醇灌胃28 d后，其體內(nèi)乙醇代謝引發(fā)多種氧化應激反應，模型組小鼠肝臟過氧化物的含量顯著升高，抗氧化能力明顯下降，蛹蟲草多糖酸奶組小鼠肝臟抗氧化能力均有所改善。模型組與空白對照組小鼠相比， GSH-Px、SOD活力顯著下降（P＜0.05）（表5）。與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組，陽性對照組GSH-Px、SOD活力均有提高。

未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對提高肝臟抗氧化的能力有一定作用，與模型組相比，GSH-Px、SOD活力分別提高7.64%、1.90%，MDA含量降低4.90%，高劑量蛹蟲草多糖酸奶與模型組相比，GSH-Px、SOD活力分別提高53.95%、25.16%，MDA含量降低49.57%，蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高脂肪代謝能力。蛹蟲草高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯對小鼠肝臟抗氧化都有很好的促進作用。

2.7 病理切片分析結(jié)果

圖 1 肝臟組織病理切片（×400）Fig. 1 Histological observation of liver tissue (× 400)

由圖1可知，空白對照組肝細胞排列規(guī)則、形態(tài)正常、無脂肪變性癥狀，肝細胞呈放射狀整齊排列，細胞核呈圓形（圖1a）；在模型組肝細胞的細胞質(zhì)中觀察到大量的脂肪或水泡變性，并且一些細胞核消失，肝索排列紊亂，肝細胞明顯腫脹，甚至出現(xiàn)肝細胞成片壞死 （圖1b）；酸奶對照組肝索排列紊亂，并且一些細胞核消失，肝細胞的細胞質(zhì)中觀察到大量的脂肪或水泡變性肝細胞明顯腫脹（圖1c）；低劑量組中肝細胞腫脹嚴重，細胞核形狀不規(guī)則，出現(xiàn)縮固現(xiàn)象（圖1d）；中劑量組中央靜脈周圍仍有部分肝細胞脂肪變性，腫脹范圍減小，程度減輕（圖1e）；高劑量組中肝細胞結(jié)構(gòu)及肝索排列基本接近正常，未見明顯細胞變性及壞死（圖1f）；陽性對照組中，肝細胞結(jié)構(gòu)及肝索排列基本接近正常，細胞核形狀規(guī)則（圖1g）。病理組織形態(tài)學觀察提示：3 種蛹蟲草多糖酸奶對小鼠酒精性肝損傷有不同程度的保護作用，其中以高劑量組保護作用比較明顯。

3 結(jié) 論

不同劑量蛹蟲草多糖酸奶組各項指標與陽性對照組各項指標具有相同的變化趨勢，肝功能與脂肪代謝功能均得到顯著改善，肝臟抗氧化能力顯著增強。且高劑量蛹蟲草多糖酸奶處理組與等劑量聯(lián)苯雙酯處理相比，大部分指標反映高劑量蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷具有同樣良好的干預作用。

酸奶對改善肝功能與脂肪代謝功能、增強肝臟抗氧化能力有一定的作用。添加蛹蟲草多糖的酸奶對小鼠酒精性肝損傷的保護作用明顯高于未添加蛹蟲草多糖的酸奶。高劑量蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷保護作用效果較好。植物乳桿菌益生發(fā)酵的蛹蟲草多糖酸奶可發(fā)揮蛹蟲草多糖和植物乳桿菌在護肝功能方面的協(xié)同作用，具有更高的效果，為蛹蟲草多糖功能性乳制品的開發(fā)推廣提供數(shù)據(jù)支持和理論指導。