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    蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷昆明種小鼠的協(xié)同保護(hù)作用

    2020-02-08 14:49:56韓瑜瑋劉洋洋
    食品科學(xué) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:小鼠劑量模型

    韓瑜瑋,劉洋洋,陳 偉

    (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安 271000)

    蛹蟲草(Cordyceps militaris(L.)Link)又稱北蟲草,是少數(shù)可以規(guī)?;a(chǎn)的食用真菌之一,也是我國最常見、分布最廣、藥用價值極高的一種蟲草菌[1]。蛹蟲草中的主要活性成分蛹蟲草多糖具有抑制腫瘤、抗炎癥、抗病毒、抑菌、調(diào)節(jié)免疫等功能[2-4]。多數(shù)研究認(rèn)為蛹蟲草多糖對肝臟的保護(hù)作用主要是通過提高機(jī)體的抗脂質(zhì)過氧化能力、改善人體細(xì)胞免疫和體液免疫及提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能實(shí)現(xiàn)[5-9]。

    發(fā)酵型酸奶有提高自由基清除能力、過氧化物清除能力,降低血清膽固醇水平的功效[11-13]。蔡宇[14]、朱蘊(yùn)蘭[15]等利用蛹蟲草菌絲體及發(fā)酵液研制了一種功能性酸奶飲料。

    隨著我國居民飲酒頻率和脂肪攝入量增加,酒精性肝損傷成為除病毒性肝炎之外的另一個重要危險因素[16]。而蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷協(xié)同保護(hù)作用的研究鮮有報道。因此,本實(shí)驗(yàn)通過蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵獲得蛹蟲草胞外多糖,以添加蛹蟲草胞外多糖及保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌3 種混菌發(fā)酵的酸奶為研究對象,灌胃酒精模型小鼠。通過生化指標(biāo)的變化分析蛹蟲草多糖酸奶對小鼠酒精性肝損傷的協(xié)同保護(hù)作用,為開發(fā)蛹蟲草多糖功能性乳制品提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    健康雄性昆明小鼠56 只,體質(zhì)量(20f 2)g,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2018-0003。

    蛹蟲草菌種,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供;植物乳桿菌發(fā)酵劑 常州益菌加生物科技有限公司;脫脂乳粉 澳大利亞邁高乳業(yè)公司。

    聯(lián)苯雙酯滴丸 萬邦德制藥集團(tuán)股份有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)測試盒、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)測試盒、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)測試盒、甘油三酯(triglyceride,TG)測試盒、總膽固醇(total cholesterol,TC)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測試盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

    PDA固體培養(yǎng)基:土豆20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、瓊脂粉2%、葡萄糖2%、K2HPO40.15%、MgSO40.10%,121 ℃滅菌20 min。

    蛹蟲草液體培養(yǎng)基:土豆2 0%、葡萄糖2%、K2HPO40.15%、MgSO40.10%,121 ℃滅菌20 min[17]。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SMP500-17805-2BF0酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技公司; TDZ5-WS臺式多管自動平衡離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司;SW-CJ-1CU潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮有限公司; 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司;RM2135石蠟切片機(jī) 德國Leica公司;HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng) 武漢千屏影像技術(shù)有限公司;YD-A型攤片機(jī)、YD-6L型冷凍工作臺、YD-6L型全自動生物組織包埋機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠。

    1.3 方法

    1.3.1 蛹蟲草多糖提取

    蛹蟲草菌種在PDA固體培養(yǎng)基中活化,在無菌條件下接種到滅菌的蛹蟲草液體培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)5~7 d,搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min,抽濾;濾液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積1/5;用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液4 ℃醇析24 h,3 800 r/min離心,獲得粗多糖;溶解至一定體積水中,以1/4體積量加入Sevag液(氯仿-正丁醇體積比4∶1),去蛋白;多糖溶液醇析24 h,3 800 r/min離心,獲得脫蛋白多糖;Sephadex G-100柱過濾層析,得到蛹蟲草多糖純品[18]。

    1.3.2 蛹蟲草多糖的分子質(zhì)量測定

    采用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)測定蛹蟲草的重均分子質(zhì)量(weight-average molecular weights,Mw)、數(shù)均分子質(zhì)量(numberaverage molecular weights,Mn)和平均分子質(zhì)量(z-average molecular weight,Mz)[18]。

    1.3.3 蛹蟲草多糖的基本指標(biāo)測定

    使用苯酚-硫酸法測定蛹蟲草多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),用Bradford的方法測定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù),通過間羥基二苯基比色法測定糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[18]。

    1.3.4 蛹蟲草多糖酸奶的配制

    加入13%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)脫脂乳粉、6%蔗糖,蛹蟲草多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.03%、0.06%、0.12%,95 ℃水浴15 min進(jìn)行巴氏殺菌,待冷卻至42 ℃,接種0.1%發(fā)酵菌粉(植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌接種質(zhì)量比為3∶1∶1),制備蛹蟲草多糖益生菌酸奶,41 ℃恒溫培養(yǎng)發(fā)酵6 h,后熟12 h,4 ℃貯存?zhèn)溆肹19]。

    1.3.5 動物分組及給藥

    小鼠隨機(jī)分7 組,每組8 只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,除空白對照組外,各組每天灌胃150 mg/kgmb體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液,建立小鼠酒精性肝損傷模型。每日灌胃相應(yīng)樣品,共給藥28 d,期間供給顆粒飼料,不限制飲食飲水。分組及給藥劑量如表1所示。

    表 1 各組小鼠的基本給藥情況(n=8)Table 1 Administration scheme for mice in each group (n= 8)

    1.3.6 檢測方法及檢測指標(biāo)

    1.3.6.1 一般情況觀察

    實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠的體質(zhì)量變化、進(jìn)食、狀態(tài)、毛發(fā)及死亡情況。

    1.3.6.2 小鼠肝臟指數(shù)測定

    小鼠肝臟指數(shù)根據(jù)下式計(jì)算。

    1.3.6.3 小鼠血清的制備

    小鼠眼球取血置于離心管中,放置30 min,3 800 r/min離心10 min,取上清液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.6.4 血液中生化指標(biāo)的測定按照試劑盒說明測定血清ALT、AST、LDL-C和HDL-C,測量血漿TG和TC水平[20]。

    1.3.6.5 小鼠肝臟組織勻漿的制備

    小鼠脫頸處死,迅速刨出肝臟組織用預(yù)冷的生理鹽水洗去殘留血,濾紙拭干,稱質(zhì)量。按1∶9(m/V)比例制成10%組織勻漿液,4 ℃條件貯存?zhèn)溆肹21]。

    1.3.6.6 肝臟組織中生化指標(biāo)的測定

    按照試劑盒說明測定SOD、GSH-Px活力及MDA含量。采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。

    1.3.6.7 病理學(xué)切片的制作

    質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定24 h,脫水透明處理,制作石蠟切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化[22]。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包完成統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異顯著性比較采用單因素方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蛹蟲草多糖的分子質(zhì)量

    蛹蟲草多糖Mw、Mn和Mz分別為2.5 8 h 1 03、1.95h 103、3.15h 103Da,Mw/Mn為1.32。

    2.2 蛹蟲草多糖的基本指標(biāo)

    蛹蟲草多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(8 4.0 2 f 3.7 5)%、(3.18f 0.12)%、(17.65f 0.07)%。

    2.3 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

    乙醇灌胃小鼠后,小鼠均表現(xiàn)出四肢癱軟等興奮狀態(tài)[22]。不同添加量(0.03%、0.06%、0.12%)蛹蟲草多糖酸奶對小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響見表2,在空白對照組和模型組之間觀察到體質(zhì)量增長比例沒有顯著的變化。與空白對照組小鼠相比,模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著提高了56.82%(P<0.05),說明乙醇能夠造成小鼠肝腫脹。與模型組相比,酸奶對照組,蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶組,陽性對照組小鼠肝臟指數(shù)分別降低3.38%、7.89%、13.21%、16.26%、25.93%。與酸奶對照組相比,高劑量蛹蟲草多糖酸奶組肝臟指數(shù)顯著下降13.13%(P<0.05)。與陽性對照組相比,低、中、高劑量蛹蟲草多糖酸奶組肝臟指數(shù)均有提高,分別提高24.35%、17.17%、13.04%。

    表 2 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on body mass and liver index in mice

    2.4 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響

    在本研究中,模型組與空白對照組相比,模型組ALT、AST活力分別增加了91.84%、65.52%(表3),表明建模成功[23]。ALT和AST均為非特異性細(xì)胞內(nèi)功能酶,在正常動物血清中的含量很低[24],當(dāng)肝細(xì)胞損傷時,肝細(xì)胞膜通透性增加,ALT、AST逸出細(xì)胞進(jìn)入血漿使酶活力增高,是臨床上常用的肝功能評價 指標(biāo)[25]。所以ALT與AST活力可以在一定程度上反映生物體內(nèi)肝細(xì)胞的損傷程度[26]。

    表 3 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠血清AST、ALT活力的影響Table 3 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on AST and ALT activities in serum of mice

    與模型組相比,酸奶對照組,蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶組,陽性對照組ALT活力分別顯著降低10.99%、33.33%、47.87%、58.87%、40.07%,AST活力下降8.74%、22.51%、34.55%、38.89%、 42.19%(P<0.05)。

    未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對肝功能有一定作用,與模型組相比,ALT、AST活力分別顯著性降低10.99%、8.74%。而高劑量蛹蟲草多糖酸奶效果更加明顯,與模型組相比,ALT活力顯著性降低58.87%,AST活力下降38.89%。說明蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高肝功能。與陽性對照組相比,蛹蟲草多糖高劑量酸奶組ALT活力顯著降低31.36%,AST活力提高5.71%,高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯同樣對小鼠肝功能有很好的改善作用。

    2.5 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝臟脂肪代謝的影響

    表 4 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠血清TG、TC、HDL-C、 LDL-C濃度的影響Table 4 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on TG, TC, HDL-C and LDL-C contents in serum of mice

    小鼠經(jīng)酒精連續(xù)灌胃28 d后,肝臟發(fā)生脂肪性病變,脂肪代謝能力下降,導(dǎo)致血液中TG、TC濃度上升[27]。模型組TG、TC濃度均明顯高于空白對照組(P<0.05),各樣品處理組與模型組相比,TG、TC濃度均降低 (表4)。與模型組相比,酸奶對照組,蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組,陽性對照組TG濃度分別下降4.43%、25.09%、33.21%、39.48%、42.44%,TC濃度分別下降4.86%、12.71%、20.75%、26.92%、31.78%。與陽性對照組相比,蛹蟲草多糖高劑量酸奶處理組TG、TC濃度分別下降5.13%、7.12%。

    HDL、LDL與膽固醇在體內(nèi)的運(yùn)輸密切相關(guān),HDL-C、LDL-C濃度會隨著血液中TG濃度的變化而改變[28-30]。同對照組相比,模型組HDL-C濃度顯著下降 (P<0.05),LDL-C濃度顯著上升(P<0.05)。與模型組相比,蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組,陽性對照組的LDL-C濃度分別降低10.24%、24.88%、30.73%、38.54%、80.00%,HDL-C濃度分別提高1.33%、7.33%、14%、20.67%、12.00%。與陽性對照組相比,蛹蟲草多糖高劑量酸奶處理組,HDL-C濃度顯著提高2.07 倍,LDL-C水平顯著提高了7.74%。

    未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對脂肪代謝能力的提高有一定作用,與模型組相比,TG、TC、LDL-C濃度顯著降低4.43%、4.86%、10.24%,HDL-C濃度提高1.33%。而高劑量蛹蟲草多糖酸奶與模型組相比,TG、TC、LDL-C濃度分別顯著降低39.48%、26.92%、38.54%,HDL-C含量顯著提高20.67%,蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高脂肪代謝能力。高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯都對小鼠肝臟脂肪代謝有很好的促進(jìn)作用。

    2.6 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力的影響

    表 5 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 5 Effect of yoghurt with Cordyceps militaris polysaccharides on SOD and GSH-Px activities and MDA level in liver of mice

    MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物[31]用于量化脂質(zhì)過氧化程度,在一定程度上反映組織損傷時出現(xiàn)的過強(qiáng)氧化作用。肝臟組織中MDA含量越高,說明其氧化活性越強(qiáng),肝臟組織受損越嚴(yán)重[32-33]。模型組與空白對照組相比,MDA含量顯著上升26.18%(P<0.05)(表5)。與模型組相比,酸奶對照組,低、中、高劑量蛹蟲草多糖酸奶組,陽性對照組差異顯著(P<0.05)。

    SOD、GSH-Px是消除活性氧的重要內(nèi)源性抗氧化酶[34]。 小鼠在40%乙醇灌胃28 d后,其體內(nèi)乙醇代謝引發(fā)多種氧化應(yīng)激反應(yīng),模型組小鼠肝臟過氧化物的含量顯著升高,抗氧化能力明顯下降,蛹蟲草多糖酸奶組小鼠肝臟抗氧化能力均有所改善。模型組與空白對照組小鼠相比, GSH-Px、SOD活力顯著下降(P<0.05)(表5)。與模型組相比,酸奶對照組,蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組,陽性對照組GSH-Px、SOD活力均有提高。

    未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對提高肝臟抗氧化的能力有一定作用,與模型組相比,GSH-Px、SOD活力分別提高7.64%、1.90%,MDA含量降低4.90%,高劑量蛹蟲草多糖酸奶與模型組相比,GSH-Px、SOD活力分別提高53.95%、25.16%,MDA含量降低49.57%,蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高脂肪代謝能力。蛹蟲草高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯對小鼠肝臟抗氧化都有很好的促進(jìn)作用。

    2.7 病理切片分析結(jié)果

    圖 1 肝臟組織病理切片(×400)Fig. 1 Histological observation of liver tissue (× 400)

    由圖1可知,空白對照組肝細(xì)胞排列規(guī)則、形態(tài)正常、無脂肪變性癥狀,肝細(xì)胞呈放射狀整齊排列,細(xì)胞核呈圓形(圖1a);在模型組肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到大量的脂肪或水泡變性,并且一些細(xì)胞核消失,肝索排列紊亂,肝細(xì)胞明顯腫脹,甚至出現(xiàn)肝細(xì)胞成片壞死 (圖1b);酸奶對照組肝索排列紊亂,并且一些細(xì)胞核消失,肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到大量的脂肪或水泡變性肝細(xì)胞明顯腫脹(圖1c);低劑量組中肝細(xì)胞腫脹嚴(yán)重,細(xì)胞核形狀不規(guī)則,出現(xiàn)縮固現(xiàn)象(圖1d);中劑量組中央靜脈周圍仍有部分肝細(xì)胞脂肪變性,腫脹范圍減小,程度減輕(圖1e);高劑量組中肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及肝索排列基本接近正常,未見明顯細(xì)胞變性及壞死(圖1f);陽性對照組中,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及肝索排列基本接近正常,細(xì)胞核形狀規(guī)則(圖1g)。病理組織形態(tài)學(xué)觀察提示:3 種蛹蟲草多糖酸奶對小鼠酒精性肝損傷有不同程度的保護(hù)作用,其中以高劑量組保護(hù)作用比較明顯。

    3 結(jié) 論

    不同劑量蛹蟲草多糖酸奶組各項(xiàng)指標(biāo)與陽性對照組各項(xiàng)指標(biāo)具有相同的變化趨勢,肝功能與脂肪代謝功能均得到顯著改善,肝臟抗氧化能力顯著增強(qiáng)。且高劑量蛹蟲草多糖酸奶處理組與等劑量聯(lián)苯雙酯處理相比,大部分指標(biāo)反映高劑量蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷具有同樣良好的干預(yù)作用。

    酸奶對改善肝功能與脂肪代謝功能、增強(qiáng)肝臟抗氧化能力有一定的作用。添加蛹蟲草多糖的酸奶對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用明顯高于未添加蛹蟲草多糖的酸奶。高劑量蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷保護(hù)作用效果較好。植物乳桿菌益生發(fā)酵的蛹蟲草多糖酸奶可發(fā)揮蛹蟲草多糖和植物乳桿菌在護(hù)肝功能方面的協(xié)同作用,具有更高的效果,為蛹蟲草多糖功能性乳制品的開發(fā)推廣提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

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