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    西番蓮種籽中總黃酮的體內(nèi)抗氧化活性及其 成分分析

    2020-02-08 14:49:56盧明劍胡志敏呂秋潔
    食品科學(xué) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:黃酮小鼠劑量

    李 焱,黃 葦,,盧明劍,胡志敏,呂秋潔

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院,廣東 廣州 510642)

    生物代謝過程中會不斷地產(chǎn)生自由基,自由基產(chǎn)生和消除之間的動態(tài)平衡被打破時,生物體將處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[1]。過量積累的自由基會通過氧化作用破壞細胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA,造成細胞的氧化損傷[2],導(dǎo)致生物體的細胞凋亡、組織受損。生物體利用內(nèi)源性和外源性抗氧化物質(zhì)來防止細胞的氧化損傷[3]。黃酮類化合物具有抗菌[4]、抗氧化自由基[5]、抗癌[6]等藥理活性,作為外源性抗氧化劑在食藥方面的應(yīng)用逐漸成為研究熱點。

    紫果西番蓮(Passiflora edulisSims)屬西番蓮科,廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū),其果汁香味濃郁,主要用于生產(chǎn)飲料。西番蓮果的種籽占整果質(zhì)量的4%~12%,含油量約占27%[7-8],但在果汁加工中一般被作為廢物丟棄。黃酮存在于西番蓮全草的不同部位,已有研究表明,其葉片中含有葒草素、異牡荊素[9]、木樨草素-7-O-葡萄糖苷[10]等,莖中含有白楊素、木樨草素[11]等,果皮中含有芹菜素-8-C-β-二氧吡啉[12]等;其種籽中也含有相當豐富的黃酮[13],但對其種籽黃酮的體內(nèi)抗氧化活性及具體成分研究鮮見報道。

    本實驗用紫果西番蓮種籽黃酮灌胃D-半乳糖氧化損傷模型小鼠,測定總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、蛋白質(zhì)羰基含量等多種生化指標,評價西番蓮種籽黃酮作為外源性抗氧化劑的體內(nèi)抗氧化活性,并采用液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometry,LC-ESI-Q-TOF-MS)技術(shù)對其成分構(gòu)成進行分析,推測出可能的裂解途徑,以期為紫果西番蓮種籽的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    SPF級昆明種雄性小鼠60 只,體質(zhì)量(20f 2)g,購自南方醫(yī)科大學(xué),生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2016-0041。

    紫果西番蓮品種為‘紫香一號’,購自廣州市天平架市場。

    AB-8大孔樹脂 東鴻化工有限公司;T-SOD、MDA、CAT、GSH-Px、蛋白質(zhì)羰基試劑盒 南京建成生物工程有限公司;甲醇、甲酸(均為色譜純) 天津市富宇精細化工有限公司;D-半乳糖、VC等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1290-6540B LC-ESI-Q-TOF-MS儀 美國安捷倫公司; 12ND冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;TGL-16M高速臺式冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限 公司;HL-2B恒流泵 上海滬粵科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 種籽黃酮的制備

    1.3.1.1 種籽黃酮的提取

    參考文獻[13]的方法,西番蓮果取汁后,種籽漂洗干凈,于55 ℃烘箱中烘干,粉碎,過孔徑0.425 mm篩。稱取適量干燥的種籽粉末,加入石油醚進行提油(85 ℃冷凝回流70 min),揮發(fā)干凈石油醚,得種籽油粕。稱取種籽油粕樣品,每克種籽油粕樣品加入56.02 mL體積分數(shù)73.78%的乙醇溶液,于超聲溫度80 ℃(冰水循環(huán))、超聲功率300 W條件下提取50 min,再置于微波處理器中,設(shè)置微波功率160 W,提取90 s。提取完畢后抽濾,濃縮至無乙醇味,真空冷凍干燥得總黃酮粗提物,備用。種籽黃酮粗提物的提取量為(117.53f 0.42)mg/g。

    1.3.1.2 種籽黃酮的純化

    預(yù)處理AB-8大孔樹脂,配制1.3.1.1節(jié)中的黃酮粗提液(質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL),調(diào)節(jié)上樣液的pH值為3, 以9 r/min流速上樣120 mL,再用150 mL的蒸餾水以 6 r/min流速淋洗,之后用90 mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液以12 r/min流速進行洗脫。取洗脫液濃縮至無乙醇味,真空冷凍干燥得到純化總黃酮,備用。種籽黃酮經(jīng)純化后純度為(70.14f 0.12)%。

    1.3.2 種籽黃酮體內(nèi)抗氧化活性的評價

    1.3.2.1 小鼠分組與處理

    參照[2012]107號《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9 個保健功能評價方法的通知》中抗氧化功能評價方法[14]及羅磊等[15]的方法設(shè)計動物實驗,以氧化損傷模型小鼠評價種籽黃酮體內(nèi)抗氧化活性。小鼠適應(yīng)性飼喂一周后,隨機分為6 組(每組10 只),設(shè)定為空白組、模型組、VC組及種籽黃酮低、中、高劑量組。除空白組皮下注射生理鹽水外,其余各組均按200 mg/(kgg d)注射D-半乳糖進行造模,各組連續(xù)注射30 d,以構(gòu)建D-半乳糖氧化損傷模型。造模的同時,種籽黃酮各劑量組分別按60、120、240 mg/(kgg d)劑量灌胃純化總黃酮,陽性對照組灌胃100 mg/(kgg d)VC,空白組和模型組灌胃生理鹽水。注射及灌胃體積均為0.1 mL/10 gmb,每日1 次,實驗期間所有小鼠不限制攝食及飲水。

    1.3.2.2 組織樣品的制備

    末次灌胃后,全部小鼠禁食12 h,摘眼球取血后脊椎脫臼法處死小鼠,取肝、腎以預(yù)冷的生理鹽水漂洗,濾紙吸干。用冰生理鹽水在4 ℃條件下勻漿組織,得到質(zhì)量分數(shù)10%的初始樣品。于4 ℃、4 500 r/min下離心10 min后取上清液,-20 ℃保存待測。

    1.3.2.3 生化指標的測定

    小鼠肝、腎組織中的T-SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA、蛋白質(zhì)羰基含量測定均按照試劑盒說明書進行。

    1.3.3 種籽黃酮成分的分析

    1.3.3.1 色譜條件

    色譜柱:Zorbax SB-C18(250 mmh 4.6 mm ,5 μm)。流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長280 nm,進樣量10 μL。采用二元高壓梯度洗脫,流動相A為甲醇,流動相B為體積分數(shù)0.25%甲酸溶液。洗脫程序:0~10 min,15%~45% A;10~20 min,4 5%~6 0% A;2 0 ~3 5 m i n,6 0%~1 0 0% A;35~40 min,100%~15% A。

    1.3.3.2 質(zhì)譜條件

    電噴霧電離正離子模式下采集數(shù)據(jù);質(zhì)量掃描范圍m/z50~1 000;毛細管電壓100 V;霧化氣壓力45 psi;干燥器流量9 L/min;干燥氣溫度300 ℃。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 種籽黃酮體內(nèi)抗氧化活性的評價結(jié)果

    SOD是一類金屬酶,其活力能反映出細胞免受氧化損傷的能力[16]。CAT可催化H2O2分解為H2O和O2,增強機體抗自由基的能力[17]。GSH-Px催化GSH與H2O2生成氧化型谷胱甘肽,其經(jīng)GSH還原酶作用,接受H+還原成GSH,GSH-Px通過上述作用保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能不受氧化損傷[18]。MDA是生物膜中多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用形成的最終產(chǎn)物之一,其含量可反映機 體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用的程度,從而間接反映細胞損傷的程度[19]。蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是其發(fā)生氧化損傷的重要標志,自由基攻擊氨基酸分子中游離氨基或亞氨基最終產(chǎn)生羰基衍生物,其含量反映了細胞氧化程度[20-21]。

    表 1 小鼠肝組織中T-SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA、 蛋白質(zhì)羰基含量Table 1 Effect of total falvonoids from the seeds of Passifolra edulis Sims on T-SOD, CAT and GSH-Px activities and MDA and protein carbonyl contents in liver tissue of mice

    表 2 小鼠腎組織中T-SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA、 蛋白質(zhì)羰基含量Table 2 Effect of total falvonoids from the seeds of Passifolra edulis Sims on T-SOD, CAT and GSH-Px activities and MDA and protein carbonyl contents in kidney tissue of mice

    由表1、2可知,模型組小鼠肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著低于空白組(P<0.05),而MDA、蛋白質(zhì)羰基含量均顯著高于空白組(P<0.05),表明模型組小鼠發(fā)生了氧化損傷,D-半乳糖氧化損傷模型建造成功。

    以中、高劑量種籽黃酮灌胃小鼠后,除了中劑量組小鼠的肝組織CAT活力和腎組織T-SOD活力以外,其余中、高劑量組小鼠肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著高于模型組(P<0.05)。與模型組相比,中劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的T-SOD活力提高了50.51%、CAT活力提高18.01%、GSH-Px活力提高29.62%,高劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的這3 種抗氧化酶活力分別提高了69.40%、38.57%、46.38%;中劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的T-SOD活力提高了0.01 倍、CAT活力提高了0.90 倍、GSH-Px活力提高了0.77 倍,高劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的這3 種抗氧化酶活力分別提高了0.36、1.39、1.41 倍。以上結(jié)果表明,肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力與種籽黃酮的灌胃劑量存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,種籽黃酮劑量越大,3 種抗氧化酶活力越高。

    中、高劑量種籽黃酮灌胃小鼠后,小鼠肝、腎組織的M D A、蛋白質(zhì)羰基含量均顯著低于模型組 (P<0.05)。與模型組相比,中劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的MDA含量降低了23.75%、蛋白質(zhì)羰基含量降低了56.02%,高劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的MDA含量降低了47.49%;中劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的MDA含量降低了75.89%、蛋白質(zhì)羰基含量降低了58.51%,高劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的MDA、蛋白質(zhì)羰基含量分別降低了78.72%、80.50%。以上結(jié)果表明,肝、腎組織的MDA、蛋白質(zhì)羰基含量與種籽黃酮的灌胃劑量存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,黃酮劑量越大,MDA、蛋白質(zhì)羰基含量越低。

    與VC組相比,種籽黃酮中劑量組小鼠肝組織的CAT、GSH-Px活力均無顯著差異(P>0.05),蛋白質(zhì)羰基含量顯著降低(P<0.05),種籽黃酮高劑量組小鼠肝組織的MDA含量無顯著差異(P>0.05);種籽黃酮中劑量組小鼠腎組織的CAT活力、GSH-Px活力、蛋白質(zhì)羰基含量均無顯著差異(P>0.05),MDA含量顯著降低(P<0.05)。這表明種籽黃酮具有較好的體內(nèi)抗氧化能力。

    2.2 種籽黃酮成分分析結(jié)果

    運用分子特征提取技術(shù)獲取檢測到的化合物信息,得到分子質(zhì)量、分子式、一級質(zhì)譜信息及二級質(zhì)譜信息,結(jié)合相關(guān)文獻報道推測裂解途徑,推測得到的化合物及結(jié)構(gòu)式如表3所示。

    表 3 可供參考的黃酮類化合物信息Table 3 Available information on four flavonoids

    化合物1:對質(zhì)荷比為m/z357的準分子離子進行單離子提取,在保留時間為17.351 min檢出目標離子。一級質(zhì)譜中給出m/z357為[M+H]+,二級質(zhì)譜給出m/z219、165、137,結(jié)合文獻[22-24]推測其裂解途徑,m/z219為黃酮母核γ-吡喃酮環(huán)裂解發(fā)生RDA(Retro-Didls-Alder)重排產(chǎn)生的奇電子碎片離子[25-26];m/z165是m/z219奇電子碎片離子上異戊基的芐基鍵斷裂產(chǎn)生的?鎓離子,同時丟失了一分子異丁烷基;m/z137是m/z165丟失一分子CO產(chǎn)生的奇電子碎片離子。推測此化合物可能為 2-(3,4-二羥基苯基)-5,7-二羥基-6-異戊基-4H-苯并吡喃-4-酮,裂解途徑如圖1所示。

    圖 1 化合物1的裂解途徑Fig. 1 Cleavage pathway of compound 1

    化合物2:對質(zhì)荷比為m/z381的準分子離子進行單離子提取,在保留時間為15.280 min檢出目標離子。一級質(zhì)譜中給出m/z381為[M+H]+,二級質(zhì)譜給出m/z349、215、161,結(jié)合文獻[23]推測其裂解途徑,m/z349為 [M-CH3OH+H]+,由γ-吡喃酮環(huán)與甲氧基之間發(fā)生i鍵斷裂產(chǎn)生;質(zhì)荷比m/z349的γ-吡喃酮環(huán)裂解發(fā)生RDA重排反應(yīng)且芳香醚發(fā)生Cü O鍵斷裂,丟失—CH3產(chǎn)生m/z215;m/z161由m/z215丟失兩分子—CO產(chǎn)生。由此推測此化合物可能為2-(4-羥基苯基)-3,6-二甲氧基-8,8-二甲基-4H,8H-吡喃并[2,3-f]苯并吡喃-4酮,裂解途徑如圖2所示。

    圖 2 化合物2的裂解途徑Fig. 2 Cleavage pathway of compound 2

    化合物3:對質(zhì)荷比為m/z399的準分子離子進行單離子提取,在保留時間為12.234 min檢出目標離子。一級質(zhì)譜給出m/z399為[M+H]+,二級質(zhì)譜給出m/z368、202、134,推測其裂解途徑,m/z368為[M-CH3OH+H]+,由γ-吡喃酮環(huán)與甲氧基之間發(fā)生i斷裂產(chǎn)生;m/z368的γ-吡喃酮環(huán)發(fā)生RDA重排反應(yīng)且失去一分子水產(chǎn)生m/z202;m/z134由m/z202發(fā)生芳香醚氫重排反應(yīng),同時丟失一分子3-甲基-1,2-丁二烯產(chǎn)生。因此推測此化合物可能為5-羥基-2-(4-羥基-3-甲氧苯基)-3-甲氧基-7-((3-甲基-2-丁烯-1-基) 氧代)-4H-苯并吡喃-4-酮,裂解途徑如圖3所示。

    圖 3 化合物3的裂解途徑Fig. 3 Cleavage pathway of compound 3

    化合物4:對質(zhì)荷比為m/z461的準分子離子進行單離子提取,在保留時間為14.892 min檢出目標離子。一級質(zhì)譜給出m/z461為[M+H]+,二級質(zhì)譜給出m/z325、269、163。推測其裂解途徑,m/z325為[M-136+H]+,由黃酮母核B環(huán)芳香醚Cü O鍵斷裂和A環(huán)芳香醚Cü O鍵斷裂產(chǎn)生[12];m/z269由m/z325丟失兩分子的—CO產(chǎn)生;m/z163為黃酮母核γ-吡喃酮環(huán)發(fā)生RDA重排反應(yīng)產(chǎn)生的奇電子碎片離子。推測此化合物可能為7-((4-甲氧芐基)氧代)-3-(2-甲氧苯基)-2-羧酸乙酯-4H-苯并吡喃-4-酮,其裂解途徑如圖4所示。

    圖 4 化合物4的裂解途徑Fig. 4 Cleavage pathway of compound 4

    3 討 論

    本實驗通過皮下注射D-半乳糖構(gòu)建氧化損傷小鼠模型,評價西番蓮種籽黃酮的體內(nèi)抗氧化活性。與空白組相比,模型組小鼠肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著降低(P<0.05),肝、腎組織的MDA、蛋白質(zhì)羰基含量均顯著升高(P<0.05),表明氧化損傷模型建造成功。與模型組相比,各劑量組隨著黃酮灌胃劑量的增大,T-SOD和CAT、GSH-Px活力逐漸增大,MDA、蛋白質(zhì)羰基含量逐漸降低,灌胃劑量與抗氧化作用存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。與VC組相比,在提高CAT、GSH-Px活力,降低MDA、蛋白質(zhì)羰基含量方面,中、高劑量種籽黃酮的作用效果較好。

    本實驗采用LC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)對西番蓮種籽黃酮成分進行分析,通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)及已報道的文獻,對裂解方式進行推測,目前可推測出4 種西番蓮種籽黃酮成分,分別為2-(3,4-二羥基苯基)-5,7-二羥基-6-異戊基-4H-苯 并吡喃-4-酮、2-(4-羥基苯基)-3,6-二甲氧基-8,8-二甲基-4H,8H-吡喃并[2,3-f]苯并吡喃-4酮、5-羥基-2-(4-羥基-3-甲 氧苯基)-3-甲氧基-7-((3-甲基-2-丁烯-1-基)氧代)-4H-苯 并吡喃-4-酮、7-((4-甲氧芐基)氧代)-3-(2-甲氧苯基) -2-羧酸乙酯-4H-苯并吡喃-4-酮。

    黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上具有酚羥基,可以作為供氫體發(fā)生自由基消除反應(yīng),另外其鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)可以螯合金屬離子,抑制脂質(zhì)氧化作用[27]。種籽黃酮通 過提高抗氧化酶活力、降低脂質(zhì)過氧化程度增強抗氧化能力[28-29],其抗氧化活性可能是這4 種黃酮成分共同作用的結(jié)果。已有的研究表明西番蓮果皮中的槲皮素[30]、葉片中的葒草素以及莖中的木樨草素與本研究中的化合物1具有相同的黃酮母核結(jié)構(gòu),但它們之間的體外抗氧化活性關(guān)系需要進一步研究。

    在軟電離條件下,黃酮類化合物母核質(zhì)譜裂解通常發(fā)生在C環(huán)上[24],本研究中的4 種黃酮物質(zhì)均發(fā)生了RDA裂解,并列出了其各自的特征碎片離子,本研究結(jié)果豐富了紫果西番蓮全草的黃酮類別。LC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)提供多級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù),在化合物結(jié)構(gòu)鑒定中應(yīng)用廣泛,但該技術(shù)難以區(qū)分化合物的同分異構(gòu)體[24],因此化合物結(jié)構(gòu)的確定還需要深入研究。

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