不同熱處理方式的α-乳白蛋白對(duì)正常人腸道 上皮細(xì)胞株增殖、周期及凋亡的影響

盛 雪，張居典，李夢(mèng)寒，崔東影，席恩澤，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）是一種由乳腺腺泡上皮合成的特殊蛋白質(zhì)，廣泛存在于人、牛、山羊、駱駝、馬等哺乳動(dòng)物的乳汁中[1]。α-LA由123 個(gè)氨基酸殘基組成，其分子質(zhì)量約為14.2 kDa[2]。α-LA在牛乳中的質(zhì)量濃度為1.0～1.5 g/L[3]，約占總蛋白的3.4%[4]；在人乳中質(zhì)量濃度為2～3 g/L[5]，占總蛋白的25%～35%[6]。研究發(fā)現(xiàn)，α-LA具有合成乳糖[7]、抑菌[8]、抗病毒[9-11]、免疫調(diào)節(jié)[12]、抗氧化[13]、抗癌[14]等多種生物學(xué)功能。我國每年有大量新生兒需要以配方奶粉為主食[15]，由于α-LA是人乳中的主要蛋白質(zhì)，因此在嬰兒配方奶粉中強(qiáng)化α-LA可以縮小牛乳喂養(yǎng)與母乳喂養(yǎng)的差距[16]。Davis等[17]研究發(fā)現(xiàn)與喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉的嬰兒相比，α-LA強(qiáng)化配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒與母乳喂養(yǎng)嬰兒的胃腸道耐受性更為相似，便秘或返流問題的發(fā)生率也隨之降低。

從食品安全和嬰兒健康的角度考慮，工廠會(huì)在乳粉生產(chǎn)時(shí)對(duì)其進(jìn)行一定程度的加熱[18]，而在加工過程中所采用的加工工藝對(duì)于嬰兒配方奶粉的營養(yǎng)、感官等都有影響，高熱處理會(huì)對(duì)牛乳成分造成較大的熱損傷，乳中乳糖異構(gòu)化和降解、乳清蛋白變性、美拉德反應(yīng)也更為嚴(yán)重[19]。α-LA作為一種熱敏性成分，巴氏殺菌是否影響其生物活性尚不明確[20]。目前我國對(duì)α-LA在嬰兒配方奶粉中的添加量沒有具體規(guī)定，巴氏殺菌后的α-LA對(duì)腸道免疫機(jī)制方面的研究也鮮見報(bào)道。

本研究以α-LA為原料，探究經(jīng)巴氏殺菌方式熱處理后的α-LA對(duì)正常人腸道上皮細(xì)胞株（human intestinal epithelial cells，HIEC）免疫活性的影響變化，探討巴氏殺菌后的α-LA對(duì)人腸道免疫作用可能的機(jī)制，從而掌握α-LA在嬰兒配方奶粉中適宜添加的劑量范圍，以及充分保持其免疫調(diào)節(jié)活性的熱加工工藝技術(shù)參數(shù)，為進(jìn)一步對(duì)新型α-LA強(qiáng)化嬰兒配方奶粉加工工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛α-LA（純度99%） 美國HILMAR公司；HIEC 北納生物細(xì)胞公司；RPMI-1640完全培養(yǎng)基、胰酶、0.25%乙二胺四乙酸 美國GIBCO公司；胎牛血清 以色列B I 公司；H a n k’s 液、二甲基亞砜 北京BioTopped公司；青霉素-鏈霉素溶液（100×）、胃蛋白酶、胰蛋白酶（≥250 U/mg） 北京Solarbio生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒 南京建成生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HF90型CO2培養(yǎng)箱 北京市六一儀器廠；BPG-9070A 型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；AE-31型 倒置顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；DSX-280B型 高壓滅菌鍋 上海申安公司； 血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；3K15型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；BSA224S型分析天平 德國Sartorius公司；Airall流式細(xì)胞儀 美國BD公司；圓二色光譜儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1α-LA的加熱處理

以工廠常用的殺菌方式為依據(jù)，確定本實(shí)驗(yàn)所用的熱處理方式為63 ℃處理30 min、72 ℃處理15 s、85 ℃處理15 s、95 ℃處理10 min。準(zhǔn)確稱量5 份α-LA，每份各1 g，加入去離子水10 mL并將其充分混合均勻，分別于63 ℃處理30 min、72 ℃處理15 s、85 ℃處理15 s、95 ℃處理10 min，另一份不做任何加熱處理。熱處理后所有α-LA樣品保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 模擬嬰兒腸道消化α-LA

配制人工胃液：取稀鹽酸用pH計(jì)調(diào)節(jié)至pH 4，每100 mL添加胃蛋白酶0.8 g（按每毫克蛋白消耗22.75 U計(jì)[21]）； 將上述4 種經(jīng)不同熱處理與未經(jīng)熱處理的α-LA溶液分別與100 mL人工胃液混合，于37 ℃恒溫?fù)u床上以135 r/min消化水解1.5 h；經(jīng)胃蛋白酶消化后的蛋白液用pH計(jì)調(diào)節(jié)至pH 6.5。

配制人工腸液：取磷酸二氫鉀0.68 g加入到上述消化液中，混合均勻后再添加膽鹽0.12 g[22]、胰蛋白酶1 g（按每毫克蛋白消耗3.45 U計(jì)[21]），不斷振蕩使其均勻混合；37 ℃恒溫?fù)u床上以135 r/min消化水解2 h，然后沸水浴5 min滅活，最后用0.22 μm濾器過濾除菌備用。得到的蛋白消化液通過真空冷凍干燥處理后，置于4 ℃保存?zhèn)溆肹23-24]。

1.3.3 不同熱處理方式的α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將63 ℃處理30 min、72 ℃處理15 s、85 ℃處理15 s、95 ℃處理10 min組與未經(jīng)熱處理的α-LA分別配制為蛋白質(zhì)量濃度0.2 g/L的溶液，取2 mL。圓二色光譜儀掃描范圍為190～250 nm，實(shí)驗(yàn)溫度為20 ℃，樣品池光程為2 mm，靈敏度為100 mdeg/cm，取8 次掃描的平均值。利用圓二色光譜儀測(cè)定α-LA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用曲線擬合軟件[25-26]計(jì)算α-LA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對(duì)含量。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑配制

將HIEC復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素溶液（100×）的 RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，并將細(xì)胞置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，每2 d更換1 次培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%左右時(shí)，按照25 cm2的培養(yǎng)瓶加入1 mL胰酶的比例加入適量胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或細(xì)胞凍存。分別將63 ℃處理30 min、72 ℃處理15 s、85 ℃處理15 s、95 ℃處理10 min組與未經(jīng)熱處理的消化后α-LA用含有3%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液（100×）的RPMI-1640培養(yǎng)液配制成0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL溶液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 不同熱處理方式的α-LA對(duì)HIEC增殖的影響

將100 μL（1h 105個(gè)/mL）處于對(duì)數(shù)生長期的HIEC接種到96 孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，分別將100 μL 0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL不同熱處理及不經(jīng)熱處理的α-LA加入含3%胎牛血清的培養(yǎng)基中，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，在避光狀態(tài)下，向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)2 h后立即使用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長處的吸光度。計(jì)算不同質(zhì)量濃度、不同熱處理方式的α-LA作用HIEC后其增殖率的變化，從而篩選出效果較佳的兩個(gè)樣品質(zhì)量濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以正常細(xì)胞為對(duì)照。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式如下。

1.3.6 不同熱處理方式的α-LA對(duì)HIEC周期的影響

用質(zhì)量濃度為0.10、0.20 mg/mL不同熱處理及不經(jīng)熱處理的α-LA分別處理HIEC 48 h后，按照細(xì)胞周期試劑盒說明書收集漂浮及貼壁細(xì)胞，用4 ℃磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞后，加入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，置于4 ℃固定24 h后，再用PBS洗滌細(xì)胞，向每組細(xì)胞樣品中加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液0.5 mL，重懸，37 ℃避光溫浴30 min，在488 nm波長處采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，數(shù)據(jù)采用ModFit LT軟件進(jìn)行分析[27]。

1.3.7 不同熱處理方式的α-LA對(duì)HIEC凋亡的影響

在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔接種5h 105個(gè)對(duì)數(shù)生長期的HIEC，鋪板24 h后，分別加入質(zhì)量濃度為0.1、 0.2 mg/mL不同熱處理及不經(jīng)熱處理的α-LA，48 h后按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書收集漂浮及貼壁細(xì)胞，用PBS洗滌1 次，隨后向細(xì)胞樣品中加入Annexin V-FITC結(jié)合液195 μL、Annexin V-FITC 5 μL，輕輕混勻，避光于室溫下孵育15 min；加入PI染色液10 μL，混勻，避光染色5 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)均使用Statistix 8軟件進(jìn)行分析，并用Origin 8.5軟件作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理方式對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜法廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，因具備測(cè)定快速、簡(jiǎn)便以及對(duì)構(gòu)象變化靈敏等特點(diǎn)，成為目前蛋白質(zhì)構(gòu)象研究的主要手段之一。通過圓二色光譜測(cè)定不同熱處理方式的α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量結(jié)果見表1。

表 1 不同熱處理方式的α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 1 Secondary structure relative contents of α-LA treated by different heating methods

由表1可知，未經(jīng)加熱處理的α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊和無規(guī)卷曲，分別占41.5%和44.9%，經(jīng)不同加熱方式處理后，α-LA的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量在一定范圍內(nèi)發(fā)生了變化，其中，經(jīng)72 ℃加熱15 s的α-LA變化最明顯。與未經(jīng)加熱處理組相比，經(jīng)72 ℃加熱15 s的α-LA的α-螺旋相對(duì)含量減少了5.9%，β-折疊和無規(guī)卷曲相對(duì)含量分別增加10.3%和1.3%，β-轉(zhuǎn)角完全消失。經(jīng)85 ℃加熱15 s的α-LA的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯改變。與未經(jīng)加熱處理組相比，經(jīng)85 ℃加熱15 s的α-LAα-螺旋相對(duì)含量減少了3.3%，β-折疊和無規(guī)卷曲相對(duì)含量分別增加5.7%和3.4%，β-轉(zhuǎn)角完全消失。綜上所述，在經(jīng)72 ℃加熱15 s和85 ℃加熱15 s的α-LA中，全部β-轉(zhuǎn)角以及部分α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊和無規(guī)卷曲。經(jīng)95 ℃加熱10 min的α-LA各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量又恢復(fù)至未經(jīng)加熱處理組水平的趨勢(shì)，這有待進(jìn)一步研究。

2.2 不同熱處理方式的α-LA對(duì)HIEC增殖的影響

細(xì)胞增殖是經(jīng)過細(xì)胞生長、DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂使細(xì)胞數(shù)目增加的過程。通過CCK-8法檢測(cè)不同熱處理方式及未經(jīng)熱處理的α-LA作用HIEC 48 h后的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖1所示。

圖 1 不同熱處理方式的α-LA對(duì)HIEC增殖作用的影響Fig. 1 Effect of α-LA with different heat treatments on the proliferation of HIEC

從圖1可以看出，與未經(jīng)加熱處理組相比，經(jīng)不同熱處理方式及未經(jīng)熱處理的α-LA在0.01～0.20 mg/mL范圍內(nèi)作用HIEC 48 h后，對(duì)HIEC的增殖能力均有促進(jìn)作用。在0.01～0.10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍，細(xì)胞增殖率隨著α-LA質(zhì)量濃度的增加而逐漸上升，并且相同條件處理樣品在不同質(zhì)量濃度下細(xì)胞增殖率存在明顯差異。在0.10～0.20 mg/mL質(zhì)量濃度范圍，隨著α-LA質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞增殖率反而逐漸降低，這可能是由于在高質(zhì)量濃度下，一部分α-LA水解物結(jié)合在一起，不能完全發(fā)揮促進(jìn)增殖的作用，這有待進(jìn)一步的研究。不同熱處理方式及未經(jīng)熱處理的α-LA均在質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)達(dá)到最大增殖促進(jìn)效果，其中，經(jīng)過72 ℃處理15 s的α-LA對(duì)HIEC的增殖促進(jìn)效果最佳，與未經(jīng)加熱處理的α-LA相比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，HIEC數(shù)量的增加與α-LA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，達(dá)到最大增殖效果時(shí)，α-LA的質(zhì)量濃度 為0.10 mg/mL，加熱方式為72 ℃處理15 s。而通過分析不同加熱方式對(duì)α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果可知，經(jīng)72 ℃處理15 s的α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化最明顯，這可能是由于加熱使α-LA促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性基團(tuán)暴露，這有待進(jìn)一步研究。

Izumi等[28]研究證實(shí)，α-LA的水解產(chǎn)物可以促進(jìn)哺乳期大鼠的腸上皮隱窩細(xì)胞增殖，增加腸道長度，促進(jìn)腸道生長和成熟。Lin等[29]研究發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度α-LA可使小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞活力增強(qiáng)。 Sternhagen等[30]也得出類似的結(jié)果，即Caco-2細(xì)胞的增殖率可在低質(zhì)量濃度的α-LA刺激下呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

本研究為了進(jìn)一步探討α-LA促進(jìn)HIEC增殖的機(jī)制是否與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)α-LA質(zhì)量濃度為0.10、0.20 mg/mL時(shí)細(xì)胞周期與凋亡率的變化。

2.3 不同熱處理方式的α-LA對(duì)HIEC周期的影響

細(xì)胞周期指細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成的過程，分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有絲分裂期（M期），長期停滯在G1期的細(xì)胞又稱為G0期。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同熱處理方式的α-LA作用HIEC 48 h后對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖 2 0.10 mg/mL α-LA對(duì)HIEC周期的影響Fig. 2 Effect of α-LA at 0.10 mg/mL on HIEC cell cycle

表 2 0.10 mg/mL α-LA作用HIEC 48 h的細(xì)胞周期分布Table 2 Cell cycle distribution of HIEC treated with α-LA at 0.10 mg/mL for 48 h

當(dāng)質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)，經(jīng)不同熱處理及未加熱處理的α-LA作用HIEC 48 h后，細(xì)胞周期中 G0/G1、S＋G2/M期的細(xì)胞分布情況如圖2、表2所示。與對(duì)照組相比，5 個(gè)給藥組G0/G1期的細(xì)胞比例均顯著減少（P＜0.05），S期和G2/M期的細(xì)胞比例均顯著增加 （P＜0.05）。結(jié)果表明，0.10 mg/mLα-LA可以促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，從而增加進(jìn)行正常分裂的細(xì)胞比例，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果；不同加熱方式處理的α-LA與未經(jīng)熱處理的α-LA相比，HIEC的周期分布變化無顯著性差異，說明本實(shí)驗(yàn)選擇的加熱方式對(duì)HIEC的細(xì)胞周期影響不明顯。

圖 3 0.20 mg/mL α-LA對(duì)HIEC周期的影響Fig. 3 Effect of α-LA at 0.20 mg/mL on HIEC cell cycle

表 3 0.20 mg/mL α-LA作用HIEC 48 h的細(xì)胞周期分布Table 3 Cell cycle distribution of HIEC treated with α-LA at 0.20 mg/mL for 48 h

當(dāng)質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL時(shí)，經(jīng)不同熱處理及未加熱處理的α-LA作用HIEC 48 h后，細(xì)胞周期中G0/G1、 S＋G2/M期的細(xì)胞分布情況如圖3、表3所示。與對(duì)照組相比，5 個(gè)給藥組的G0/G1期的細(xì)胞比例均有所降低， S＋G2/M期的細(xì)胞比例增加，但差異不顯著。結(jié)果表明，0.20 mg/mLα-LA對(duì)HIEC的細(xì)胞周期影響不大；α-LA對(duì)HIEC周期的影響具有一定的劑量依賴性，與細(xì)胞增殖的結(jié)果一致。

2.4 不同熱處理方式的α-LA對(duì)HIEC凋亡的影響

細(xì)胞凋亡指由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同熱處理方式的α-LA作用HIEC 48 h后對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖 4 0.10 mg/mL α-LA對(duì)HIEC凋亡的影響Fig. 4 Effect of α-LA at 0.10 mg/mL on apoptosis of HIEC

表 4 0.10 mg/mL的α-LA作用HIEC 48 h的細(xì)胞凋亡率Table 4 Apoptosis rates of HIEC treated with α-LA at 0.10 mg/mL for 48 h

當(dāng)質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)，經(jīng)不同熱處理及未經(jīng)加熱處理的α-LA作用HIEC 48 h后，細(xì)胞凋亡情況如圖4、 表4所示。與對(duì)照組相比，5 個(gè)給藥組的細(xì)胞晚期凋亡率以及總凋亡率均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，0.10 mg/mLα-LA對(duì)HIEC凋亡有明顯抑制作用，并且這種作用不受本實(shí)驗(yàn)中加熱方式的影響。

圖 5 0.20 mg/mL α-LA對(duì)HIEC凋亡的影響Fig. 5 Effect of α-LA at 0.20 mg/mL on apoptosis of HIEC

表 5 0.20 mg/mL α-LA作用HIEC 48 h的細(xì)胞凋亡率Table 5 Apoptosis rates of HIEC treated with α-LA at 0.20 mg/mL for 48 h

當(dāng)質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL時(shí)，經(jīng)不同熱處理及未經(jīng)加熱處理的α-LA作用HIEC 48 h后，HIEC凋亡情況如 圖5、表5所示。5 個(gè)給藥組細(xì)胞總凋亡率與對(duì)照組相比均有所降低，但差異不顯著。說明0.20 mg/mLα-LA對(duì)HIEC凋亡率影響不大；α-LA抑制HIEC凋亡的作用效果具有一定劑量依賴性，與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

不同熱處理α-LA對(duì)HIEC增殖的作用效果具有一定的劑量依賴性，其作用機(jī)制與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)。根據(jù)HIEC的來源和特性，本研究結(jié)果表明，優(yōu)化的熱處理牛α-LA在適宜的添加量下應(yīng)用于嬰兒配方奶粉中，可能發(fā)揮促進(jìn)嬰兒腸道上皮細(xì)胞生長，進(jìn)而調(diào)節(jié)嬰幼兒免疫的能力。推薦熱處理α-LA的添加量為0.10 mg/mL，與乳粉加工巴氏殺菌方式結(jié)合的最佳熱處理工藝條件為72 ℃、15 s，以保持α-LA的生物活性。其具體應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)需進(jìn)一步研究。