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    黑靈芝多糖對丙烯酰胺致大鼠肝臟氧化 損傷的保護作用

    2020-02-08 14:49:36江國勇雷艾彤謝建華
    食品科學(xué) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:肝細胞毒性活力

    江國勇,雷艾彤,楊 瑩,余 強,謝建華,陳 奕

    (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌 330047)

    丙烯酰胺(acrylamide,AA)是一種應(yīng)用廣泛的工業(yè)化學(xué)品,同時還普遍存在于炸、烘、烤等高溫食品中,與人類生活環(huán)境密切相關(guān)[1-3]。然而,AA具有多種生理毒性,已被國際癌癥研究機構(gòu)列為“可能人類致癌物”(2A類)[4]。由于AA是一種水溶性小分子物質(zhì),滲透性強,人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸并吸收AA,在消化過程中可以快速分布于全身的組織中造成毒性[5]。肝臟是AA毒性的靶器官之一,研究表明AA能誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生過量活性氧(reactive oxygen species,ROS),消耗解毒過程中的重要物質(zhì)谷胱甘肽(glutathione,GSH)并引起脂質(zhì)過氧化(丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增高),引起肝細胞氧化損傷[6-8]。

    以往對AA的研究主要集中在其形成抑制方面,尤其是在熱加工過程中如何采取各種措施以降低食品中AA的含量,然而,中西方飲食習(xí)慣導(dǎo)致人體無法避免地長期暴露在低水平AA環(huán)境下。因此如何削弱AA體內(nèi)毒性,尋找可拮抗AA毒性的天然產(chǎn)物,構(gòu)建人類AA毒性防護的第二道屏障具有重要意義。近年來大量研究表明,多種植物來源天然產(chǎn)物對生物來源的ROS具有顯著的清除和抑制作用。Gedik[9]和Shrivastava[10]等研究發(fā)現(xiàn),藏紅花素和橙皮素處理AA染毒的大鼠后,抗氧化酶活力得到顯著提升,炎癥緩解,一定程度上緩解了AA毒性。Alturfan等[11]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對AA致大鼠氧化應(yīng)激和DNA氧化損傷起到保護作用。大型植物真菌黑靈芝(Ganoderma atrum)在我國作為藥食同源食品已有2 000多年歷史,然而關(guān)于黑靈芝來源的天然產(chǎn)物對于AA體內(nèi)毒性的抑制作用尚無報道。本課題組的前期研究[12-13]報道了一種從黑靈芝子實體中分離出的黑靈芝多糖(Ganoderma atrumpolysaccharides,PSG),對其結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn),PSG的主要水溶性成分PSG-1是一種由酸性1,3-糖苷鍵連接支鏈、1,6-糖苷鍵連接β-Glcp主鏈的雜多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物,其分子質(zhì)量為1 013 kDa,由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸以物質(zhì)的量比為4.91∶1∶1.28∶0.71組成。眾多體內(nèi)外研究表明PSG具有抗氧化防御能力,能夠改善過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,在清除自由基功能方面尤其突出[14-16]。

    本課題組最近一項研究[17]表明,PSG能通過改善IEC-6細胞氧化應(yīng)激和線粒體凋亡途徑有效抑制AA毒性,然而到目前為止,關(guān)于PSG對AA誘導(dǎo)的肝臟損傷是否具有保護作用鮮見報道。因此,本研究旨在探討PSG對AA誘導(dǎo)大鼠肝臟氧化損傷的保護作用,以期為PSG的充分應(yīng)用與深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù),同時為AA膳食防治提供指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    黑靈芝購于江西贛州靈芝基地。清潔級雄性SD大鼠(體 質(zhì)量160~180 g,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2016-0002,使用許可證號:SYXK(贛)2005-0001)購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

    AA(純度>99.9%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、甘油三酯(triglyceroles,TG)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、BCA蛋白濃度試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司;白細胞介素(interleukin,IL)-1β、 I L-1 0 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 武漢博士德 公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    3K15高速臺式離心機 德國Sigma公司;3001全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(多功能酶標儀) 美國Thermo公司;A10超純水儀 美國Millipore公司;2HWY-2102生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器公司;KZ-II組織破 碎儀 武漢塞維爾生物科技有限公司;AL104型電子 天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 PSG的提取制備

    黑靈芝子實體經(jīng)粉碎機反復(fù)粉粹處理至粉狀細微顆粒,用體積分數(shù)95%乙醇溶液浸泡24 h后,采用改良的熱水浸提醇沉法提取PSG。將浸提液旋蒸濃縮至原體積1/5,采用Sevag法脫蛋白處理,脫蛋白后依次用自來水透析2 d、蒸餾水透析1 d、超純水透析1 d,再用體積分數(shù)95%乙醇溶液沉淀,沉淀物分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌2 次,濃縮,冷凍干燥,得到精制PSG。

    1.3.2 AA誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型的建立

    選取健康雄性SD大鼠60 只,體質(zhì)量160~180 g,于12 h明暗交替條件下適應(yīng)1 周。隨機分為6 組,每組10 只:1)正常組:等體積的生理鹽水;2)模型組:20 mg/kgmbAA溶液;3)陽性對照組:200 mg/kgmbN-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC);4)PSG低、中、高劑量組:PSG 50、100、200 mg/kgmb。各給藥組在給予相應(yīng)藥物0.5 h后,口腔灌胃AA水溶液,連續(xù)30 d。最后1 次給藥后,禁食不禁水18 h處死,進行相關(guān)指標測定。

    1.3.3 大鼠一般情況觀察

    實驗期間觀察大鼠的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度、有無死亡情況等,拍照并記錄。

    1.3.4 肝臟病理檢測

    取大鼠肝臟部分右葉(后續(xù)測定取肝臟左葉相應(yīng)部位),生理鹽水清洗,濾紙吸干,于體積分數(shù)10%中性福爾馬林溶液中固定,石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色,光鏡下觀察組織切片并拍照。

    1.3.5 肝功能指標測定

    采用眼球取血法,室溫放置2 h,待血清分層后于4 000 r/min、4 ℃下冷凍離心10 min,吸取上層血清部分,-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。按照檢測試劑盒步驟測定血清ALT、AST、ALP活力和TG濃度。

    1.3.6 肝臟氧化指標測定

    稱取100 mg肝臟組織加入900 μL生理鹽水制備肝臟組織勻漿液,于8 000 r/min、4 ℃下離心15 min,吸取上清液,根據(jù)檢測試劑盒步驟測定SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量。

    1.3.7 免疫指標測定

    采用1.3.5節(jié)所制血清樣品,按照檢測試劑盒步驟測定血清IL-Iβ、IL-10質(zhì)量濃度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有實驗均重復(fù)3 次, 結(jié)果以平均值±標準差表示;采用Graph Pad Prism 6 軟件作圖;采用單因素方差分析和Tukey’s多因素t檢驗進行方差分析,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大鼠一般情況觀察及死亡率

    在AA造模期間,各組大鼠均未出現(xiàn)中毒死亡。AA染毒第20天,模型組大鼠開始出現(xiàn)抱團嗜睡、后肢癱瘓并容易被激怒的現(xiàn)象,且毛發(fā)凸起失去光澤(圖1B),表明灌胃AA第20天AA的蓄積毒性作用開始體現(xiàn)。

    圖 1 AA造模期間大鼠一般情況Fig. 1 General conditions of normal and AA-treated rats

    2.2 PSG對AA致大鼠肝臟組織病理變化的影響

    圖 2 PSG對AA致大鼠肝臟損傷的組織病理變化影響 (HE染色)(200×)Fig. 2 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on AA-induced hist opathological changes in rats (HE staining) (200 ×)

    由圖2可知:正常組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常,肝細胞以中央靜脈為中心,向四周呈發(fā)散性排列,細胞排列致密,肝細胞索排列規(guī)律,無充血和炎性細胞浸潤,核仁清晰(圖2A);模型組肝索斷裂,細胞質(zhì)大量丟失,空泡嚴重,且細胞核固縮較嚴重,出現(xiàn)炎癥細胞浸潤 (圖2B);相對于模型組,陽性對照組和PSG低劑量組肝索恢復(fù),核仁清晰,排列整齊,空泡化現(xiàn)象基本緩解,僅有少量細胞質(zhì)丟失(圖2C、D);PSG中、高劑量組基本接近于正常組(圖2E、F)。上述結(jié)果表明,AA染毒使大鼠肝細胞核固縮,細胞質(zhì)丟失,導(dǎo)致肝細胞壞死,從而損傷肝臟組織;而PSG和陽性藥物干預(yù)處理后,肝細胞組織形態(tài)趨于正常,提示PSG對AA致大鼠肝臟損傷具有較好的保護作用。

    2.3 PSG對AA致大鼠肝臟功能損傷的影響

    圖 3 PSG對AA致大鼠肝功能損傷的影響Fig. 3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on liver function injury induced by AA in rats

    由圖3可知,與正常組相比,模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP活力均極顯著升高(P<0.01),TG濃度顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,NAC處理后,陽性對照組大鼠血清中AST活力和TG濃度得到一定程度降低,但不顯著,ALT和ALP活力顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,低、中、高劑量PSG處理后,大鼠AST、ALT、ALP活力和TG濃度均極顯著降低(P<0.01),降低程度遠大于陽性對照組。結(jié)果表明,AA染毒后各項肝功能指標顯示大鼠肝臟受到損傷,同時PSG對AA致大鼠肝損傷具有顯著的保護作用,且其效果遠遠優(yōu)于NAC。

    2.4 PSG對AA致大鼠肝臟氧化損傷的影響

    氧化應(yīng)激是肝臟損傷的重要機制之一。體內(nèi)自由基代謝的平衡主要通過抗氧化系統(tǒng)維持,主要包括SOD、GSH-Px、CAT等,MDA是脂質(zhì)過氧化物降解的主要產(chǎn)物,MDA的含量也能間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[18]。

    由表1可知,模型組大鼠中MDA含量極顯著高于正常組(P<0.01),NAC和低、中、高劑量PSG均能夠極顯著降低大鼠體內(nèi)MDA含量(P<0.01)。灌胃AA后,肝組織抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活力均極顯著降低(P<0.01),而NAC和不同劑量PSG處理均能不同程度地提升抗氧化酶活力,且PSG尤其是高劑量時,其提升抗氧化酶活力的能力遠大于NAC。結(jié)果提示,PSG能夠維持大鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng),提高抗氧化酶活力,同時降低脂質(zhì)過氧化,從而緩解AA導(dǎo)致的大鼠肝臟損傷。

    2.5 PSG對AA致大鼠肝臟損傷中血清炎癥因子水平的影響

    圖 4 PSG對AA致大鼠肝臟損傷中血清炎癥因子IL-1β(A)、IL-10(B)質(zhì)量濃度的影響Fig. 4 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on serum IL-1β (A) and IL-10 (B) levels in rats with AA-induced liver injury

    炎癥細胞因子參與炎癥反應(yīng),在眾多炎癥細胞因子中,起主要作用為IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子等。由圖4可知,與正常組相比,模型組大鼠中血清IL-1β質(zhì)量濃度極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,陽性對照組和PSG處理組大鼠體內(nèi)IL-1β質(zhì)量濃度均顯著降低(P<0.01,P<0.05)。與模型組相比,中、高劑量PSG能夠極顯著提高血清IL-10質(zhì)量濃度(P<0.01)。以上結(jié)果表明,灌胃不同劑量的PSG均可以有效緩解AA導(dǎo)致的炎癥反應(yīng),抑制AA誘導(dǎo)的大鼠肝組織中促炎細胞因子IL-1β的表達,并提高抗炎因子IL-10水平,從而達到對肝臟的保護作用。

    3 討 論

    AA對人類健康造成潛在的重大風(fēng)險,包括致突變性、遺傳毒性、致癌性[19]。肝臟是主要的解毒代謝器官,因此也成為AA的主要靶器官之一。本實驗結(jié)果表明,AA處理后,大鼠血清AST、ALT和ALP活力 (P<0.01)及TG濃度(P<0.05)顯著或極顯著增加。ALT和AST是動物體內(nèi)2 種重要的轉(zhuǎn)氨酶,正常情況下在血清中很少,但當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時,肝細胞結(jié)構(gòu)受到一定破壞,AST、ALT就會漏出至血液,因此血清中AST、ALT活力變化可以作為肝臟受到損害時的一種應(yīng)答反應(yīng)[20-21]。 肝臟受損時膽汁循環(huán)受阻,ALP活力升高,同時導(dǎo)致機體對游離脂肪酸的利用減少,血液中游離脂肪酸水平升高,導(dǎo)致血清中TG濃度升高,因此血清中TG濃度也間接反映了肝臟受損程度[22]。氧化應(yīng)激是AA損傷的主要機制之一[2]。Jiang Guoyong等[17]的研究結(jié)果提示,在IEC-6細胞模型中,AA能刺激IEC-6細胞產(chǎn)生過量ROS。Ghorbel等[1]發(fā)現(xiàn)不同劑量的AA可誘導(dǎo)破壞肝細胞中促氧化劑和抗氧化劑平衡而引起氧化損傷。機體接觸AA后會通過酶與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生ROS。當(dāng)ROS增多至超過機體清除自由基能力時,機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)就會失衡,從而發(fā)生氧化損傷。Luo等[23]研究發(fā)現(xiàn)AA及其代謝物(縮水甘油酰胺)能與GSH結(jié)合形成共軛異構(gòu)體,AA給藥后體內(nèi)GSH水平降低。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,GSH消耗可能會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物。MDA水平升高提示機體可能發(fā)生了氧化損傷,機體抗氧化系統(tǒng)平衡遭到破壞[24]。當(dāng)機體氧化應(yīng)激第一道防線被突破,過多的ROS開始攻擊DNA生物大分子,引起DNA損傷。氧化應(yīng)激通過核因子κB激活產(chǎn)生炎癥因子并發(fā)生炎癥 反應(yīng)[25]。因此本研究采用自由基清除能力突出的PSG干預(yù)AA毒性作用,并進行肝臟組織病理觀察,測定血清AST、ALT、ALP活力、TG濃度等肝臟功能指標,機體氧化與抗氧化系統(tǒng)狀態(tài),及相關(guān)免疫因子評價AA誘導(dǎo)的肝臟損傷情況。肝損傷組織病理學(xué)特征表明,與模型組大鼠相比,PSG處理緩解了AA誘導(dǎo)的肝細胞損傷。AA可以促進自由基產(chǎn)生并誘導(dǎo)肝組織損傷[26]。動物造模后各項肝功能指標均與正常組差異顯著(P<0.01、P<0.05),提示肝損傷模型成功。進一步評價機體氧化/抗氧化系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),AA處理后機體內(nèi)產(chǎn)生過量ROS,抗氧化系統(tǒng)紊亂,主要表現(xiàn)為抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力極顯著降低(P<0.01)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)含量極顯著升高(P<0.01),最終導(dǎo)致肝臟發(fā)生氧化損傷,這與Yu Rongmin等[27]的研究結(jié)果相一致。在氧化損傷情況下,ROS攻擊生物大分子并促使機體產(chǎn)生炎癥因子。本實驗中,AA處理后大鼠體內(nèi)促炎因子IL-1β質(zhì)量濃度極顯著上升(P<0.01)。

    PSG良好的生物功能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密不可分。本課題組前期研究中,PSG具有良好的體外抗氧化活性,這可能主要歸因于其中的酚類和蛋白質(zhì)成分[28]。文獻[29]報道,真菌提取物中常見的酚類化合物,如酚酸類、酚類衍生物具有良好的抗氧化活性。酚類物質(zhì)的抗氧化活性可認為是氫在氧化反應(yīng)中充當(dāng)了H-或者電子供體的角色,最終終止氧化電子反應(yīng)鏈[30]。另外,抗氧化活性多肽或蛋白中典型的氨基酸包括親核含硫氨基酸、芳香族氨基酸、咪唑氨基酸等組分也在PSG中發(fā)現(xiàn)[12]。進一步探討其與免疫活性的關(guān)系發(fā)現(xiàn),PSG免疫活性與其蛋白質(zhì)、總酚、中性糖含量均無明顯關(guān)系,但與糖醛酸含量呈現(xiàn)線性關(guān)系,其中酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖結(jié)構(gòu)對PSG發(fā)揮免疫活性具有關(guān)鍵性作用。

    4 結(jié) 論

    綜上所述,作為天然活性產(chǎn)物來源,PSG可以提高AA誘導(dǎo)肝損傷大鼠體內(nèi)抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px) 活力,降低促炎因子(IL-1β)、提高抗炎因子(IL-10)質(zhì)量濃度,一定程度地恢復(fù)肝臟功能和修復(fù)組織病理損傷。PSG對AA誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷具有保護作用,作用機制可能與其酚類蛋白成分的抗氧化作用和酸性β-(1→3,1→6)葡聚糖結(jié)構(gòu)的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。上述研究對于治療或早期預(yù)防AA毒性具有重要的理論意義和實踐價值,也能為膳食營養(yǎng)提供科學(xué)指導(dǎo)和實驗依據(jù),同時也為以PSG為原料的高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供積極的影響。

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