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    高壓均質(zhì)對大豆分離蛋白乳液流變學(xué)特性和 氧化穩(wěn)定性的影響

    2020-02-08 14:49:28劉競男徐曄曄王一賀孫洪蕊王喜波江連洲
    食品科學(xué) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:界面

    劉競男,徐曄曄,王一賀,孫洪蕊,王喜波,,江連洲

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林 長春 130000)

    許多食品屬于水包油(O/W)型乳液體系,如牛奶、飲料、調(diào)味醬和調(diào)味品等,是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系,經(jīng)常出現(xiàn)聚結(jié)、絮凝和脂質(zhì)氧化等問題[1]。氧化會影響以乳狀液形式存在的食品穩(wěn)定性[2],導(dǎo)致感官品質(zhì)劣變[3],出現(xiàn)如氣味難聞、營養(yǎng)素降解和色澤變化等現(xiàn)象[4]。

    高壓處理可以改變大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)的天然構(gòu)象,影響其諸多功能特性[5]。Wang Xiansheng等[6]研究發(fā)現(xiàn),高壓處理會使球蛋白的結(jié)構(gòu)展開,同時伴隨著亞基的解離與重聚,顯著改善球蛋白的溶解性、乳化性等特性。高壓均質(zhì)技術(shù)可以提高食品加工的效率[7],還能顯著提高乳液體系的物理和微生物穩(wěn)定性[8],有利于乳液食品的貯存。

    乳液流變學(xué)特性與其內(nèi)部體系緊密相關(guān),乳液的流變行為也能夠反映乳液穩(wěn)定性[9]。目前關(guān)于SPI乳液流變學(xué)特性的研究和報道越來越多,Rosech等[10]研究通過高壓均質(zhì)處理的大豆?jié)饪s蛋白乳液流變學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)乳液能夠形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),且穩(wěn)定性增強(qiáng)。Liu Fu等[11]研究發(fā)現(xiàn),超高壓處理SPI乳液可以通過增加乳化能量輸入,促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。目前提高SPI氧化穩(wěn)定性主要是通過添加抗氧化劑、表面活性劑等方式,李秋慧等[12]采用酶法改性磷脂,通過添加適量的改性磷脂提高大豆蛋白的氧化穩(wěn)定性。關(guān)于高壓均質(zhì)對SPI氧化穩(wěn)定性的影響研究較少,F(xiàn)ernández-ávila等[13]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過超高壓(100~300 MPa)處理大豆蛋白乳液,300 MPa處理后的乳液氧化穩(wěn)定性下降,脂質(zhì)氧化乳劑強(qiáng)烈依賴于油滴中油相的體積分?jǐn)?shù)和蛋白質(zhì)附著。本實驗主要研究了不同均質(zhì)次數(shù)對SPI乳液體系平均粒徑、乳析指數(shù)、界面蛋白吸附量、流變學(xué)特性以及氧化穩(wěn)定性的影響,并通過光學(xué)顯微鏡對SPI乳液進(jìn)行觀察,以期為高穩(wěn)定型乳液食品的實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大豆由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供;大豆油 九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司;三氯乙酸 永華精細(xì)化學(xué)品有限公司;十二烷基硫酸鈉、Tris 美國Sigma公司;四乙氧基丙烷 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T18 Basic型高速分散機(jī)/勻漿機(jī) 德國IKA公司;LD4-2A型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;AVP-2000型高壓均質(zhì)機(jī) 英國Stansted Fluid Power公司;Mastersizer 2000型激光粒度分析儀、Bohlin Gemini 2型旋轉(zhuǎn)流變儀 英國Malvern公司;ALPHA1-4 LSC型冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司;YS100型生物顯微鏡 日本Nikon 公司;HYP-314型消化爐、KDN-102C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 SPI的制備

    根據(jù)Sorgentini等[14]方法制備SPI。大豆粉碎并過60 目篩,用索氏提取器經(jīng)過乙醚提取后獲得脫脂豆粕。再將脫脂豆粕與蒸餾水以體積比1∶10混合。用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 8.5,室溫攪拌2 h。4 000hg離心2 min,取上清液,用2 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 4.5,將樣品置于4 ℃條件下靜置過夜,4 000hg離心5 min,將獲得的沉淀物水洗兩次,復(fù)溶后調(diào)至pH 7.0,倒平板, -18 ℃預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥。

    1.3.2 乳液的制備

    將SPI溶于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白溶液,加入疊氮化鈉 (0.02 g/mL),室溫攪拌2 h,水化過夜。加入體積分?jǐn)?shù)為20%大豆油,使用分散機(jī)處理1 min,轉(zhuǎn)速為 10 800 r/min,得到初乳液。然后以120 MPa均質(zhì)壓力處理,均質(zhì)循環(huán)次數(shù)分別為0(未處理)、1、2、3、4 次,每次5 s。分別貯藏0、2、4、6、8、12 d。

    1.3.3 粒徑測定

    將處理后的SPI樣品分別用去離子水稀釋至質(zhì)量濃度1 mg/mL,在粒度測定儀上進(jìn)行測定,參數(shù)設(shè)置為:顆粒折射率(1.460),分散劑折射率(1.330)。

    1.3.4 乳析指數(shù)的測定

    參照Firebaugh等[15]的方法稍作修改,測定乳液的乳析指數(shù)。取10 mL乳液置于玻璃管中(高度12 cm、直徑1.5 cm),密閉保存。室溫貯藏10 d,觀察乳液的狀態(tài),上層為乳析層,下層為清液層。乳析指數(shù)計算公式 如式(1)所示。

    式中:Hs為下層清液高度/cm;Ht為整個乳液的 高度/cm。

    1.3.5 光學(xué)顯微鏡觀察

    將不同高壓均質(zhì)次數(shù)處理后的乳液振蕩混合均勻,取少量新鮮乳液置于載玻片的中心,蓋上蓋玻片,將其置于光學(xué)顯微鏡的觀察區(qū),將放大倍數(shù)調(diào)整為100 倍,觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)。

    1.3.6 界面蛋白吸附量的測定

    根據(jù)Desrumaux等[16]的方法略作改動,取50 mL待測乳液于離心管中,室溫下離心(15 000hg、45 min),用注射器小心吸取底部清液于另一離心管中,再次離心(15 000hg、45 min),收集下層清液,用凱氏定氮法測定清液中的蛋白含量Ci(CNh 6.25),界面蛋白吸附量(C)的計算公式如式(2)所示。

    式中:C0為初始乳液中蛋白的含量/(mg/mL);Ci為乳狀液中未吸附蛋白的含量/(mg/mL)。

    1.3.7 表觀黏度的測定

    取樣品于旋轉(zhuǎn)流變儀感應(yīng)板上,平板直徑為40 mm,間距為15 mm,剪切速率0.01~100 s-1,選取30 個取樣點,溫度為25 ℃,平衡時間為1 min。測試前需將待測樣品置于室溫下放置30 min,取2 mL乳液于平板間隙并在樣品四周覆蓋硅油。

    1.3.8G’和G”的測定

    取樣品于旋轉(zhuǎn)流變儀感應(yīng)板上,平板直徑為40 mm,檢測間隙為15 mm,在應(yīng)變力為0.5%的條件下進(jìn)行頻率掃描,頻率范圍為0.1~10 Hz,測定溫度為25 ℃,以角頻率為橫坐標(biāo),彈性模量(G’)和黏性模量(G”)為縱坐標(biāo),繪制曲線。

    1.3.9 氧化穩(wěn)定性的測定

    1.3.9.1 初級氧化產(chǎn)物

    氫過氧化物值的測定參考Shao Yun等[17]的方法并稍加修改,將添加0.02 g/mL疊氮化鈉的乳液分裝在密封玻璃試管中,于50 ℃烘箱中加速氧化。隔天取出,進(jìn)行氫過氧化物值的測定。具體方法為:將異辛烷和異丙醇按照體積比3∶1混合,即為溶劑1。將甲醇和丁醇按照體積比2∶1混合,即為溶劑2。取0.2 mL樣品,加入1.5 mL溶劑1。充分振搖,3 400hg離心2 min,吸取200 μL上層有機(jī)相,加入2.8 mL溶劑2混勻。加入0.3 g/mL硫氰酸銨和亞鐵離子溶液(0.264 moL/L氯化鋇和0.288 mol/L硫酸亞鐵混合后離心)各15 μL,室溫靜置20 min,于510 nm波長處測吸光度。用過氧化氫作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品中的氫過氧化物值。

    1.3.9.2 次級氧化產(chǎn)物

    硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值的測定參考S?rensen等[18]的方法,取3 mL乳液于試管中,加入6 mL三氯乙酸試劑(7.5 g/mL)混合并漩渦混勻,將得到的混合物用1 μm微孔濾膜過濾,取2 mL濾液置于含有硫代巴比妥酸試劑(0.8 g/mL)的試管中,混合均勻。將混合物95 ℃水浴15 min處理,然后立即在冰水浴中冷卻,在532 nm波長處記錄最終提取物的吸光度。乳液中TBARS值通過1,1,3,3-四乙氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    所有的實驗重復(fù)3 次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析 (P<0.05);采用Origin 9軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高壓均質(zhì)對SPI乳液粒徑的影響

    圖 1 均質(zhì)次數(shù)對SPI乳液平均粒徑的影響Fig. 1 Effect of homogenization cycles on average particle size of SPI-stabilized emulsion

    高壓均質(zhì)處理對SPI乳液平均粒徑的影響如圖1所示,不同均質(zhì)次數(shù)處理后樣品的平均粒徑均低于未處理樣品。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加,體積平均粒徑先減小后緩慢增加。在均質(zhì)3 次時,乳液體系平均粒徑達(dá)到最小值(0.73 μm),說明高壓均質(zhì)處理會導(dǎo)致SPI乳液粒徑降低,隨著均質(zhì)次數(shù)的增加效果更好。增加均質(zhì)次數(shù)即增加了輸入能量,Lizarraga等[19]發(fā)現(xiàn),增加輸入能量,乳狀液粒徑分布向低粒徑趨勢轉(zhuǎn)移,即乳滴粒徑減小。均質(zhì)4 次時,乳滴粒徑增大,可能是乳液發(fā)生“過處理” 現(xiàn)象[20],由于高壓處理使乳滴粒徑過小,顆粒之間布朗運(yùn)動速率加快,增加了相互碰撞的次數(shù),從而破壞界面膜,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集;同時,高壓均質(zhì)作用也會引起蛋白變性[16],蛋白相互作用導(dǎo)致聚集,從而使溶解度下降,蛋白從界面脫落,阻礙了均質(zhì)對液滴的破壞,減弱了均質(zhì)的效果[21]。

    2.2 SPI乳液的微觀結(jié)構(gòu)

    不同均質(zhì)次數(shù)處理的SPI乳液顯微結(jié)構(gòu)如圖2所示,乳滴以絮凝的形式存在,未經(jīng)處理的乳液油滴數(shù)目多,且大小不均一,說明發(fā)生了聚結(jié)現(xiàn)象,乳液不穩(wěn)定。經(jīng)均質(zhì)處理1~2 次時,仍可見較小尺寸的油滴,但并未有強(qiáng)烈的聚結(jié)現(xiàn)象(大尺寸油滴)。在均質(zhì)3~4 次時均未出現(xiàn)油滴,乳液的粒徑明顯減小,說明高壓均質(zhì)作用可以阻止聚結(jié)現(xiàn)象的發(fā)生。

    圖 2 不同均質(zhì)次數(shù)處理SPI乳液的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Optical microstructure of SPI-stabilized emulsion subjected to different homogenization cycles

    2.3 高壓均質(zhì)對SPI乳液乳析指數(shù)的影響

    圖 3 均質(zhì)次數(shù)對SPI乳液的乳析指數(shù)的影響Fig. 3 Effect of homogenization cycles on creaming index of SPI-stabilized emulsion

    圖3為貯存10 d后不同高壓均質(zhì)次數(shù)處理條件下乳液的乳析指數(shù),未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的初乳液乳析指數(shù)最高,為67.64%;高壓均質(zhì)處理后的乳液乳析指數(shù)較未處理乳液大幅下降,均質(zhì)3 次和4 次時未發(fā)生乳析現(xiàn)象,說明高壓均質(zhì)處理能夠提高乳液穩(wěn)定性。Fernández-ávila等[13]也在研究中發(fā)現(xiàn),利用高壓均質(zhì)技術(shù)能生產(chǎn)出物理穩(wěn)定性較高的SPI乳液。其原因可能是隨著高壓均質(zhì)次數(shù)的增加,蛋白乳液被高壓剪切力切割形成小分子,使蛋白顆粒粒徑減小,更多的蛋白吸附至油-水界面,為液滴間提供足夠的排斥力,從而阻止乳層析的發(fā)生,使蛋白乳液的貯存穩(wěn)定性增強(qiáng)。Li Jinlong等[22]研究指出,乳液粒徑減小、比表面積增加,液滴之間的摩擦力增加,乳液的黏度增大,使乳液聚合速率減緩,從而提高乳液穩(wěn)定性。這也解釋了隨均質(zhì)次數(shù)的增加乳液表觀黏度增加這一變化趨勢產(chǎn)生的原因。

    2.4 高壓均質(zhì)對SPI乳液界面蛋白吸附量的影響

    界面的蛋白含量對乳狀液的穩(wěn)定性有重要影響[23]。界面蛋白吸附量越高,蛋白吸附至水-油界面的能力越強(qiáng)。均質(zhì)次數(shù)對SPI乳液界面蛋白吸附量影響結(jié)果如圖4所示,高壓均質(zhì)處理1~4 次后,其界面蛋白吸附量分別為93.32%、94.14%、95.63%、94.31%,顯著高于未經(jīng)處理的乳液(86.73%)。高壓均質(zhì)處理能夠提高蛋白的柔性結(jié)構(gòu)[24],使蛋白空間結(jié)構(gòu)展開,更多的疏水基團(tuán)暴露,促使更多的蛋白吸附到油-水界面,并在乳液界面形成蛋白膜,故高壓均質(zhì)處理可以提高界面蛋白吸附量[25]。界面蛋白吸附量隨著均質(zhì)次數(shù)的增加而先增加后降低,均質(zhì)4 次時略有降低,可能是因為界面膜已經(jīng)達(dá)到蛋白的最大吸附量。當(dāng)界面蛋白吸附量達(dá)到一定值時,蛋白之間的相互作用反而抑制連續(xù)相中蛋白的進(jìn)一步吸附[26]。

    圖 4 均質(zhì)次數(shù)對SPI乳液界面蛋白吸附量的影響Fig. 4 Effect of homogenization cycles on interfacial protein adsorption of SPI-stabilized emulsion

    2.5 高壓均質(zhì)對SPI乳液表觀黏度的影響

    圖 5 不同均質(zhì)次數(shù)SPI乳液的表觀黏度隨剪切速率的變化Fig. 5 Apparent viscosity versus shear rate curves of emulsion subjected to different homogenization cycles

    根據(jù)Stoke定律,當(dāng)乳液體系黏度較大時,液滴的上浮速率減緩,有利于乳液保持更好的穩(wěn)定性[27]。由圖5可以看出,經(jīng)高壓均質(zhì)處理的乳液表觀黏度隨剪切速率的增加而下降,發(fā)生了非牛頓流體的剪切稀化現(xiàn)象[28]。在未受到剪切力時,流體分子間相互纏結(jié)在一起;在剪切力的作用下,流體動力將破壞體系中的絮凝物,聚集的脂肪球破碎,液滴定向排布阻力減小,乳液表觀黏度減小。剪切速率增加到一定值后,分子間排列完成,黏度不再變化[29]。

    乳液表觀黏度隨均質(zhì)次數(shù)增加呈先升高后降低的趨勢,均質(zhì)3 次的乳液表觀黏度最大,這與乳析指數(shù)的結(jié)果一致。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加,乳液粒徑減小,分散相中液滴數(shù)目增加,兩個液滴進(jìn)入相互吸引區(qū)的機(jī)會迅速增加,從而使其位移困難,導(dǎo)致乳液表觀黏度增大。當(dāng)均質(zhì)4 次時,乳液表觀黏度反而降低。Perrier-Cornet等[30]的研究表明,蛋白顆粒粒徑較大容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集,隨著蛋白顆粒粒徑的增大,其聚集更加明顯。這可能是由于隨著均質(zhì)次數(shù)的增多,體系出現(xiàn)了“過處理”效應(yīng),部分解離的SPI分子重新聚集,通過新的二硫鍵形成復(fù)雜的聚集體[31],從而使乳液表觀黏度降低。

    2.6 高壓均質(zhì)對SPI乳液剪切流變行為的影響

    圖 6 不同均質(zhì)次數(shù)SPI乳液G’和G”隨角頻率的變化Fig. 6 Curves of G’ and G” values versus angle frequency with different homogenization cycles

    乳液的流變學(xué)性質(zhì)可以反映乳液分散體系的貯藏穩(wěn)定性[32]。G’和G”的變化趨勢如圖6所示,未處理的乳液G’和G”很小,接近0 Pa。但經(jīng)高壓均質(zhì)處理后,乳液G’和G”明顯增加,表明高壓均質(zhì)處理可以提高乳液的G’和G”。處理后乳液的G’都大于相應(yīng)的G”,表現(xiàn)出明顯的彈性行為,表明以彈性為主的凝膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加,G’和G”呈先增加后降低的趨勢,當(dāng)均質(zhì)3 次時,G’和G”最大。這與乳析指數(shù)的結(jié)果一致。當(dāng)均質(zhì)4 次時,乳液均質(zhì)發(fā)生“過處理”現(xiàn)象,蛋白質(zhì)相互作用并發(fā)生聚集,由于空間位阻作用抑制了后續(xù)吸附蛋白質(zhì)的去折疊,從而使蛋白質(zhì)分子間的相互作用位點不易接近,減小了G’和G”[33]。高壓均質(zhì)作用提高了SPI的表面疏水性和柔性[34],蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合,增加了G’[35]。同時,高壓均質(zhì)作用使乳液粒徑降低,更多的蛋白顆粒吸附到油-水界面上,由于蛋白顆粒對油滴的穩(wěn)定作用,蛋白形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而提高乳液黏度,并增加了乳液的G’,進(jìn)而增強(qiáng)了乳液穩(wěn)定性。

    2.7 高壓均質(zhì)對SPI乳液氧化穩(wěn)定性的影響

    圖 7 高壓均質(zhì)對SPI乳液初級氧化產(chǎn)物的影響Fig. 7 Effect of high pressure homogenization on hydroperoxide value of SPI-stabilized emulsion

    圖 8 高壓均質(zhì)對SPI乳液TBARS值的影響Fig. 8 Effect of high pressure homogenization on TBARS value of SPI-stabilized emulsion

    如圖7、8所示,隨著貯存時間的延長,脂肪氧化程度逐漸加深,蛋白乳液的氫過氧化物值增加,體系TBARS值呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢。氫過氧化物能夠被分解轉(zhuǎn)化為次級氧化產(chǎn)物[36],從而導(dǎo)致TBARS值增加。當(dāng)貯存4 d時,氧化過程中部分次級氧化產(chǎn)物可能轉(zhuǎn)化為其他氧化成分[37],從而使TBARS值下降。在貯存6 d后,TBARS值再次增加,可能是由于氫過氧化物含量增加較快且極易分解,其分解速率大于次級氧化產(chǎn)物的分解速率。

    高壓均質(zhì)處理樣品的氫過氧化物值和TBARS值均低于未處理樣品,在均質(zhì)3 次時,其氫過氧化物值和TBARS值均最低。這是由于高壓均質(zhì)處理使蛋白顆粒減小,更多的蛋白吸附至油-水界面并維持乳液穩(wěn)定,在水相和油相之間形成空間位阻。此外,乳液中的蛋白質(zhì)吸附在油滴表面后形成一層黏彈性蛋白膜,蛋白膜可以有效阻止脂質(zhì)氧化的引發(fā)劑擴(kuò)散到油滴內(nèi)部,同時限制水相中的過渡金屬與油相相互作用,從而起到抑制油脂氧化的作用[17]。Ries[38]和Mei Longyuan[39]等的研究也表明,粒徑較小的乳液在貯藏過程中測得的脂質(zhì)過氧化物和揮發(fā)性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量都更少。因此,均質(zhì)3 次時,乳液體系的氧化穩(wěn)定性更佳。

    3 結(jié) 論

    隨均質(zhì)次數(shù)的增加,乳液粒徑先減小后增加,乳析指數(shù)呈降低趨勢,在均質(zhì)3 次和4 次時未發(fā)生乳析現(xiàn)象,表明乳液體系穩(wěn)定性更好。根據(jù)微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果,隨著均質(zhì)次數(shù)的增加,油滴尺寸逐漸減小至消失,乳滴粒徑逐漸減小,且分布逐漸均勻,說明高壓均質(zhì)作用可以阻止聚結(jié)現(xiàn)象發(fā)生。

    隨著均質(zhì)次數(shù)的增加,界面蛋白吸附量、表觀黏度、G’和G”均呈先增加后減小的趨勢,在均質(zhì)3 次時達(dá)到最大,說明此時乳液體系的穩(wěn)定性最佳。剪切流變學(xué)特性實驗結(jié)果說明高壓均質(zhì)處理的乳液具有良好的動力學(xué)穩(wěn)定性。

    高壓均質(zhì)處理的樣品氫過氧化物值和TBARS值均低于未處理樣品,說明高壓均質(zhì)作用能夠抑制脂肪氧化。隨著貯存時間的延長,乳液體系的氫過氧化物值增加,TBARS值呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢。當(dāng)均質(zhì)3 次時,乳液體系的氫過氧化物值和TBARS值最低,即氧化穩(wěn)定性更佳。

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