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    谷物蛋白體外消化率測(cè)定方法的修正

    2020-02-08 14:49:26劉艷美周學(xué)永付榮霞AngadiHonnursabRAJASAB肖建中
    食品科學(xué) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:解液谷物消化率

    劉艷美,周學(xué)永,,付榮霞,Angadi Honnursab RAJASAB,肖建中

    (1.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心,天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384;2.古爾伯加大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院,印度 古爾伯加 585308;3.天津市黑馬工貿(mào)有限公司,天津 301711)

    谷物蛋白消化率是指在一定條件下,蛋白質(zhì)被蛋白酶水解為肽類(lèi)及氨基酸等可溶性物質(zhì)氮含量占谷物蛋白總氮量的比例[1-3],也有文獻(xiàn)將其理解為可溶性蛋白質(zhì)量占物料蛋白總質(zhì)量的比例[4-5]。蛋白質(zhì)消化率的傳統(tǒng)測(cè)定采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行[6],雖然結(jié)果準(zhǔn)確,但評(píng)價(jià)過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且成本較高。谷物蛋白消化率的體外測(cè)定具有速度快、成本低的優(yōu)勢(shì),因此受到了國(guó)內(nèi)外的廣泛重視,并取得重要進(jìn)展。目前胃-胰蛋白酶兩步體外消化法已成為測(cè)定谷物蛋白體外消化率的主要方法[6-10],其原理是將谷物蛋白進(jìn)行酶解,然后過(guò)濾得到未被酶解的殘留蛋白,利用谷物粗蛋白總量扣除未被酶解的殘留蛋白量,即可計(jì)算谷物蛋白的體外消化率。

    然而筆者在研究中發(fā)現(xiàn),文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)谷物蛋白體外消化率的測(cè)定方法,在操作步驟上存在一定的差異,對(duì)于蛋白沉淀劑三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)的使用描述不一致,甚至出現(xiàn)了相互矛盾的測(cè)定步驟,這可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生重要影響。例如, 黃滄海[2]、張麗英[5]、王衛(wèi)國(guó)[11]等將飼料酶解后直接抽濾,濾渣烘干后用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量,然后利用飼料總蛋白含量扣除酶解后的殘留蛋白含量,計(jì)算得出樣品的蛋白消化率;而朱逸欣等[12]在飼料酶解液過(guò)濾前,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的TCA沉淀溶液中的蛋白質(zhì),然后過(guò)濾沉淀,利用凱氏定氮法測(cè)定濾渣中殘留蛋白含量,計(jì)算蛋白消化率。唐茂妍[13]、梁明[14]和武建堂[15]等則在酶解液過(guò)濾前,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的磺基水楊酸以沉淀蛋白質(zhì),余下步驟與前述相同并計(jì)算蛋白消化率。

    綜合分析上述測(cè)定方法可知,酶解液在過(guò)濾前是否加TCA或磺基水楊酸以沉淀蛋白質(zhì),已成為上述兩類(lèi)操作方法的主要區(qū)別。筆者認(rèn)為,由于谷物酶解液除了含有谷物蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物外,還含有酶解時(shí)加入的胃蛋白酶和胰蛋白酶,因此,TCA、磺基水楊酸這些蛋白沉淀劑的加入勢(shì)必會(huì)引起胃-胰蛋白酶的沉淀,這將影響過(guò)濾殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量,進(jìn)而影響蛋白體外消化率的測(cè)定結(jié)果。

    為了規(guī)范谷物蛋白質(zhì)體外消化率的測(cè)定方法,本研究選取大米、小米、玉米和藜麥[16-17]4 種谷物,采用胃蛋白酶-胰酶兩步法測(cè)定其蛋白質(zhì)消化率,并在酶解液過(guò)濾前分別進(jìn)行加TCA與不加TCA的對(duì)比實(shí)驗(yàn)操作,通過(guò)比較這兩種操作方法對(duì)蛋白消化率測(cè)定結(jié)果的影響程度,最終確定合理的實(shí)驗(yàn)操作步驟。本研究對(duì)規(guī)范谷物蛋白消化率的實(shí)驗(yàn)操作具有參考意義和應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    藜麥由山西華青藜麥生物科技有限公司提供;大米由天津市寶坻區(qū)歡喜稻蟹養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社提供;小米(‘晉谷21’)和玉米(‘中地88’)由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供。胃蛋白酶(10 000 IU/g)和胰蛋白酶(30 000 IU/g)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。鹽酸、氫氧化鈉、TCA、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    YB-250型高速多功能粉碎機(jī) 永康市速峰工貿(mào)有限公司;HNY-200D型恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;H2050R型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;UDK 159型全自動(dòng)凱氏定氮儀 意大利VELP公司;MAPADA型紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 4 種谷物總蛋白含量的測(cè)定

    將谷物粉碎,按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定蛋白含量。

    1.3.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶溶液的配制

    準(zhǔn)確移取6.1 mL濃鹽酸,加蒸餾水稀釋到1 000 mL。將上述稀鹽酸加熱升溫到42~45 ℃,取下,加入20 g活力為10 000 IU/g的生化級(jí)胃蛋白酶。輕輕搖動(dòng)使其溶解,得到胃蛋白酶質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液,酶活力為200 IU/mL。

    準(zhǔn)確稱(chēng)取3.521 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4g 2H2O),溶于100 mL蒸餾水,得到濃度為0.2 mol/L的磷酸二氫鈉溶液;準(zhǔn)確稱(chēng)取7.164 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4g 12H2O),溶于100 mL蒸餾水,得到濃度為0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液。

    準(zhǔn)確移取5.3 mL 0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液和94.7 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液,配制成100 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液(p H 8.0),將上述溶液加熱升溫到4 2 ~4 5 ℃,加入0.5 g 活力為3 0 0 0 0 I U/g 的生化級(jí)胰蛋白酶。輕輕搖動(dòng)使其溶解,得到胰蛋白酶質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液,酶活力為150 IU/mL。

    1.3.3 谷物蛋白體外消化率的測(cè)定(加TCA)

    采用胃-胰蛋白酶兩步消化法測(cè)定4 種谷物蛋白質(zhì)體外消化率[18-19],具體操作如下:稱(chēng)取1.0 g谷物(精確至0.000 1 g)于100 mL離心管中,加入pH 2.0的胃蛋白酶溶液(20 mg/mL)10 mL,將離心管置于(37f 1)℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中,振搖速率190 r/min。3 h后取下,添加0.5 mol/L NaOH溶液2.0 mL和pH 8.0的胰蛋白酶溶液(5 mg/mL)30 mL,混合液于37 ℃繼續(xù)振搖2 h。取出離心管,立即加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA 10 mL,搖勻后靜置1 h以沉淀未降解成氨基酸和小分子肽的可溶性蛋白質(zhì)。在4 ℃下離心(11 000 r/min、20 min),去上清液,沉淀用蒸餾水洗滌、離心,重復(fù)兩次。取沉淀,于60 ℃烘箱烘干,采用凱氏定氮法測(cè)定沉淀物的蛋白含量,按公式(1)計(jì)算體外消化率。

    1.3.4 谷物蛋白體外消化率的測(cè)定(不加TCA)

    除不加TCA沉淀蛋白外,其他操作步驟同1.3.3節(jié)。

    1.3.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定精確稱(chēng)取0.2 g胃蛋白酶或胰蛋白酶,按照GB 5009.5—2016 測(cè)定胃蛋白酶或胰蛋白酶中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

    1.3.6 TCA對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶沉淀的影響

    1.3.6.1 胃蛋白酶與胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    以水為參照,將胃蛋白酶和胰蛋白酶分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的水溶液,在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,利用吸光度與蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.6.2 TCA加入量對(duì)蛋白酶溶液沉淀效果的影響

    按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA溶液與胃蛋白酶或胰蛋白酶溶液體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1混合后,室溫沉淀1 h,離心(11 000 r/min、10 min),取上清液在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。根據(jù)蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中未沉降的蛋白酶質(zhì)量濃度。以蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),以TCA溶液與蛋白酶溶液之間的體積比為橫坐標(biāo),繪制蛋白酶沉降曲線。按式(2)計(jì)算蛋白沉降率。

    1.3.6.3 胃-胰蛋白酶沉淀物中蛋白背景值的測(cè)定

    不加谷物樣品,按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行操作,胃-胰蛋白混合酶溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA溶液10 mL后靜置、抽濾,測(cè)定沉淀中蛋白質(zhì)量。按式(3)計(jì)算蛋白干擾率。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,若差異達(dá)到顯著 (P<0.05),則進(jìn)行Duncan’s法多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白含量

    胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示。

    表 1 胃蛋白酶和胰蛋白酶中蛋白含量Table 1 Protein contents in pepsin and trypsin

    由表1可看出,胃蛋白酶中蛋白含量為7.67 g/100 g,胰蛋白酶中蛋白含量為8.47 g/100 g。在谷物酶解液中,胃蛋白酶加入量為200 mg,其中蛋白質(zhì)量為15.34 mg;胰蛋白酶加入量為150 mg,其中蛋白質(zhì)量為12.71 mg,兩種酶中蛋白總質(zhì)量為28.05 mg。在消化率的測(cè)定過(guò)程中,谷物用量為1 000 mg,因此,如果胃-胰 蛋白酶能夠全部被TCA沉淀,則將導(dǎo)致谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果偏高2.80%。

    2.2 TCA對(duì)胃蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度的影響

    質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 0% T C A 與胃蛋白酶溶液(酶液初始質(zhì)量濃度4.76 mg/mL,其中蛋白質(zhì)量濃度為 4.76 mg/mLh 7.67%=0.365 mg/mL)分別按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的體積比混合后,室溫沉淀1 h,離心(11 000 r/min、10 min),取上清液測(cè)蛋白質(zhì)量濃度,結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖 1 TCA加入量對(duì)胃蛋白酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度影響Fig. 1 Effect of TCA on protein concentration in pepsin solution

    由圖1 可見(jiàn),胃蛋白酶中蛋白質(zhì)初質(zhì)量濃度為0.365 mg/mL,隨著TCA溶液加入體積的增加,酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度逐漸減小。當(dāng)TCA溶液與胃蛋白酶溶液體積比為4∶1時(shí),酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度基本保持不變。根據(jù)胃蛋白酶沉降曲線,最終確定TCA溶液與胃蛋白酶溶液體積比為4∶1,即可達(dá)到最佳的蛋白沉淀效果。

    不過(guò)從圖1可以看出,胃蛋白酶沉淀并不完全,當(dāng)TCA與胃蛋白酶溶液體積比在1∶1~5∶1之間變化時(shí),胃蛋白酶的沉降率為39.28%~58.92%。以最高的沉降率計(jì)算,胃蛋白酶(用量200 mg)在測(cè)定過(guò)程中對(duì)谷物沉淀蛋白含量的干擾率為0.9%。

    2.3 TCA對(duì)胰蛋白酶濾液中蛋白質(zhì)濃度的影響

    質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA與胰蛋白酶溶液(酶液初始質(zhì)量濃度3.57 mg/mL,其中蛋白質(zhì)量濃度為3.57 mg/mLh 8.47%=0.302 mg/mL)分別按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的體積比混合后,室溫沉淀1 h。離心(11 000 r/min、10 min),取上清液測(cè)蛋白質(zhì)量濃度,結(jié)果見(jiàn)圖2。

    圖 2 TCA加入量對(duì)胰蛋白酶溶液中蛋白濃度影響Fig. 2 Effect of TCA on protein concentration in trypsin solution

    由圖2 可見(jiàn),胰蛋白酶中蛋白初始質(zhì)量濃度為0.302 mg/mL,隨TCA溶液體積的增加,胰蛋白酶中蛋白質(zhì)量濃度有明顯下降趨勢(shì)。當(dāng)TCA溶液與胰蛋白酶溶液之比為4∶1時(shí),胰蛋白酶中蛋白濃度已基本不再變化。根據(jù)胰蛋白酶沉降曲線,確定V(TCA)∶V(胰蛋白酶溶液)為4∶1即可達(dá)到最佳的蛋白沉淀效果。當(dāng)V(TCA)∶V(胰蛋白酶溶液)在1∶1~5∶1之間變化時(shí),胰蛋白酶的沉降率為50.33%~80.13%。以最高的沉降率計(jì)算,胰蛋白酶(用量150 mg)在測(cè)定過(guò)程中對(duì)沉淀蛋白含量的干擾率為1.02%。

    對(duì)比圖1與圖2可知,TCA溶液對(duì)胰蛋白酶的沉降效果優(yōu)于胃蛋白酶。沉淀效果的差異可能與二者的等電點(diǎn)有關(guān)。胰蛋白酶的等電點(diǎn)pI為10.8[20],而胃蛋白酶具有極低的等電點(diǎn)(如豬胃蛋白為pH 1.0)[21]。在相同的酸性沉淀?xiàng)l件下,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)越高,其所帶正電荷的數(shù)量越多,就越容易與帶負(fù)電荷的TCA形成沉淀。

    2.4 TCA對(duì)谷物蛋白體外消化率測(cè)定的影響

    谷物蛋白酶溶液在過(guò)濾前采取加入TCA與不加入TCA兩種操作,過(guò)濾得到的沉淀中蛋白含量差異見(jiàn)表2。

    表 2 TCA對(duì)酶解過(guò)濾沉淀中蛋白含量的影響Table 2 Effect of TCA on protein content in precipitates from hydrolysate filtration

    由表2可知,谷物蛋白酶解液在過(guò)濾前采取加入TCA后,沉淀中蛋白質(zhì)含量明顯增加,除了大米之外,均有顯著性差異(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),谷物粗蛋白質(zhì)含量越高,TCA對(duì)沉淀蛋白含量的增加效果就越明顯。胃-胰蛋白酶的沉淀不是導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果升高的唯一原因。結(jié)合前述2.1~2.3節(jié)的研究結(jié)果可知,胃-胰蛋白酶沉淀對(duì)谷物蛋白含量的影響不會(huì)超過(guò)1.92%(胃蛋白酶0.9%,胰蛋白酶1.02%),而TCA對(duì)小米和藜麥沉淀蛋白含量的影響均超過(guò)了2%。因此可以認(rèn)為,除了蛋白酶之外,可溶性谷物蛋白也發(fā)生了沉淀,且谷物蛋白初始含量越高,沉淀現(xiàn)象就越明顯。

    在表2數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上對(duì)谷物蛋白體外消化率進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果列于表3。

    表 3 TCA加入對(duì)谷物蛋白體外消化率的影響Table 3 Effect of TCA on the in vitro digestibility of cereal protein

    根據(jù)蛋白體外消化率計(jì)算公式,谷物酶解后的沉淀中殘留蛋白含量越高,蛋白消化率的計(jì)算結(jié)果就越低,也就是說(shuō),TCA的加入對(duì)沉淀蛋白含量的影響及其對(duì)消化率的影響恰好呈相反趨勢(shì)。由表3可知,谷物蛋白酶解液如果采取不加TCA而直接過(guò)濾的操作方式,蛋白消化率測(cè)定結(jié)果將明顯偏高(P=0.002<0.01),其中大米、玉米、小米、藜麥4 種谷物蛋白的體外消化率分別提高了2.85%、3.42%、15.97%和18.74%,酶解液過(guò)濾前添加TCA能夠糾正結(jié)果偏高現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn),谷物蛋白初始含量越高,TCA對(duì)其蛋白消化率的影響就越大。造成這種現(xiàn)象的原因推測(cè)有兩個(gè):一是酶解液中存在未被胃-胰蛋白酶降解成小分子肽及氨基酸的可溶性蛋白質(zhì),TCA的加入促使這些蛋白進(jìn)入沉淀中,導(dǎo)致消化率計(jì)算結(jié)果降低;二是酶解液中谷物蛋白、胃蛋白酶和胰蛋白酶在TCA的作用下發(fā)生共沉淀,引起消化率測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步降低??梢赃@樣認(rèn)為,加入TCA使谷物中可溶性蛋白形成沉淀屬于正常糾偏,而使胃-胰蛋白酶發(fā)生沉淀則屬于過(guò)度糾偏。

    一般而言,谷物蛋白在酶解過(guò)程中首先是溶解,其次是降解。因此,谷物中粗蛋白含量越高,酶解一定時(shí)間后其所含有的可溶性蛋白含量就越高,相應(yīng)地被TCA所沉淀的蛋白數(shù)量就越多,消化率測(cè)定結(jié)果的下降程度也就越大。就蛋白的共沉淀而言,有研究認(rèn)為,植物蛋白在采取等電點(diǎn)沉淀、酸-熱沉淀等提取過(guò)程中,可以與蛋類(lèi)蛋白、血蛋白、酵母蛋白形成共沉淀,最終得到多種蛋白的混合物[22-24]。在本研究中,谷物蛋白含量越高,酶解液中就蛋白質(zhì)量濃度就越大,加入TCA時(shí)蛋白沉降現(xiàn)象就越明顯。在這種情況下,谷物蛋白會(huì)對(duì)酶蛋白形成包裹而一同沉淀。在共沉淀過(guò)程中,相同濃度的TCA會(huì)導(dǎo)致更多的胃-胰蛋白酶發(fā)生沉淀,對(duì)結(jié)果的干擾程度增大。因此,谷物蛋白與胃-胰蛋白酶形成共沉淀是一個(gè)不容忽視的因素。

    2.5 TCA法測(cè)定谷物蛋白體外消化率的公式修正

    通過(guò)上述分析可知,在酶解法測(cè)定谷物蛋白消化率的過(guò)程中,不加TCA會(huì)引起測(cè)定結(jié)果偏高,而加入TCA又會(huì)同時(shí)引起谷物可溶性蛋白和酶的一同沉淀,最終導(dǎo)致結(jié)果偏低。因此,該測(cè)定方法必須加以修正,需要合理扣除胃-胰蛋白酶沉淀所造成的影響。本研究提出了修正公式(式(4))。

    式中:NT為蛋白樣品總的粗蛋白含量/(g/100 g);Nf為樣品消化結(jié)束時(shí)加入T C A 后沉淀中蛋白含 量/(g/100 g);Ne為胃-胰蛋白酶混合液與TCA形成沉淀中的蛋白含量/(g/100 g)。

    4 種谷物采用修正公式得到的蛋白消化率結(jié)果列于表4。由表4可以看出,修正后谷物蛋白消化率測(cè)定數(shù)值均較修正前有所升高,提高幅度在1.78%~3.39%之間。因此,在谷物蛋白體外消化率的測(cè)定中,不扣除胃-胰蛋白酶空白對(duì)照值將導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。

    表 4 修正前后4 種谷物蛋白消化率的比較(TCA法)Table 4 Comparison of protein digestibility of four kinds of grains before and after modification (TCA method)

    3 討 論

    3.1 蛋白體外消化率的概念有待進(jìn)一步明確

    蛋白質(zhì)體外消化率測(cè)定方法不統(tǒng)一,源于對(duì)蛋白質(zhì)體外消化率概念認(rèn)識(shí)上的差異。比如有文獻(xiàn)認(rèn)為, 蛋白質(zhì)的消化率是指可溶性蛋白質(zhì)占物料總蛋白質(zhì)的比例[4-5,25];但也有文獻(xiàn)認(rèn)為,蛋白質(zhì)的體外消化率是指蛋白質(zhì)被蛋白酶水解為肽類(lèi)及氨基酸等可溶性物質(zhì)氮含量占谷物蛋白總氮量的比例[1-3]。基于第二種觀點(diǎn)考慮,加入TCA的目的是沉淀未被降解成小肽及氨基酸的可溶性蛋白質(zhì)。從人體和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)吸收的原理進(jìn)行分析,在酶解液中加入TCA的操作是有道理的,但一定要扣除TCA與胃-胰蛋白酶沉淀所造成的干擾,否則仍然不能得出準(zhǔn)確結(jié)果。

    3.2 正確扣除TCA-酶蛋白沉淀的背景值

    既然TCA能夠與胃蛋白酶和胰蛋白酶形成沉淀而對(duì)谷物蛋白體外消化率的測(cè)定形成干擾,那么在測(cè)定過(guò)程中就應(yīng)該扣除這一干擾。有文獻(xiàn)采用式(5)計(jì)算谷物蛋白體外消化率[26-29]。

    式中:N0為蛋白樣品加入TCA后測(cè)定的不溶性氮 質(zhì)量/mg;Nt為蛋白樣品消化t時(shí)刻加入TCA后的不溶性氮質(zhì)量/mg。

    在上述公式中,谷物粗蛋白測(cè)定過(guò)程中也加入了TCA,其目的就是通過(guò)平行操作的方式以扣除TCA的干擾,其實(shí)這種操作沒(méi)有抓住問(wèn)題的關(guān)鍵。因?yàn)樵诠任锎值鞍卓偭繙y(cè)定過(guò)程中,谷物完全在消化管中消化,通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)沒(méi)有任何損失,故在此步驟加TCA沒(méi)有任何作用。而在谷物酶解之后加入TCA,胃蛋白酶和胰蛋白酶會(huì)一同沉淀,外源蛋白(胃-胰蛋白)對(duì)測(cè)定結(jié)果干擾仍然存在。因此,上述處理并沒(méi)有真正扣除胃-胰酶蛋白的空白對(duì)照值。

    4 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)以大米、玉米、小米、藜麥4 種谷物為研究對(duì)象,采用胃-胰蛋白酶兩步法,在酶解液過(guò)濾前分別進(jìn)行加TCA與不加TCA的對(duì)比研究。結(jié)果表明,不加TCA沉淀酶解液中的可溶性谷物蛋白將導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高,而加入TCA但不扣除胃-胰蛋白酶空白對(duì)照值,則導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。本研究認(rèn)為,采用沉淀法測(cè)定谷物蛋白體外消化率時(shí),以加入TCA沉淀劑為宜,但在計(jì)算過(guò)程中必須單獨(dú)扣除胃-胰蛋白酶的空白對(duì)照值。

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